土鳖虫，又称虫、地鳖虫、土元等，始载于《神农本草经》，是中国传统的具有活血化瘀功效的动物药。古代著名医家刘完素曾说道：“郁而不散为壅，必以宣剂以散之。”又如清代医家叶天士曰：“久则邪正混处其间，草木不能见效，当以蚁虫疏通逐邪。”指出土鳖虫、水蛭、天龙等善于钻入狭缝孔隙的动物药，有化瘀通络、祛瘀生新的功效。其雌虫体具有散血瘀、消坚结、解凝活血、接骨续筋、消肿止痛、下乳通经等功效^[1]。有文献报道其对血液流变性各参数的改善作用较强，进一步证明其较强的活血化瘀作用^[2]。土鳖虫的主要活性成分包括多种活性蛋白质（酶）、氨基酸、生物碱、脂溶性维生素及脂肪酸、微量元素、挥发油等，以及分离得到的核苷类化合物尿嘧啶和尿囊素，有镇静作用且外用有促进皮肤溃疡面和伤口愈合及生肌作用^[3]。

1 实验材料 1.1 仪器

R-301型旋转蒸发器（上海申顺生物科技有限公司）；CT-241电渗析仪（浙江赛特膜技术有限公司）；卷式超滤膜（1KDa、3KDa）（北京市旭邦膜设备有限责任公司）；LGJ-10C型真空冷冻干燥机（杭州大卫科教仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；AL-204型万分之一天平；KQ-500E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；UV-1100型紫外-可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）；ermeGear垂直透皮扩散渗透仪（上海玉研科学仪器有限公司）。

1.2 试药及试剂

胰蛋白酶（批号F20071228），酶活力2 000 U/mg；胃蛋白酶（批号F20110712），酶活力3 000 U/mg（均购自上海蓝季科技发展有限公司产品）；分子量标准品：牛血清白蛋白（MW66430）（上海源叶生物科技有限公司）。

土鳖虫药材（雌虫干燥体，购自济南建联中药店），经山东中医药大学郭庆梅老师鉴定为鳖蠊科中华真地鳖（Eupolyphaga sinensis Walker）的雌虫干燥体。

硫化钠、氯化钠、丙三醇、三乙醇胺、氮酮，以上试剂均为分析纯，卡波姆940，蒸馏水。

SD大鼠，SPF级，体质量200~250 g，由山东中医药大学实验动物中心提供，合格证为SCXK（鲁）201300010。

2 方法与结果 2.1 土鳖虫活性小肽制备

将土鳖虫药材粉碎过60目筛，取1 000 g，加10倍量纯水，煮沸20 min，待水液降温至40 ℃，用稀盐酸溶液调pH至1.5左右，加胃蛋白酶适量，40 ℃保温酶解2 h；再用稀氢氧化钠溶液调pH至8.0左右，加入胰蛋白酶适量，40 ℃保温酶解4 h^[4]；煮沸10 min灭酶，迅速冷却至室温，放置冰箱低温（4 ℃左右）冷藏过夜，离心（4 500 r/min）10 min，取上清液经电渗析仪除盐得土鳖虫酶解液^[5]，再依次用过分子截留量为3 KDa、1 KDa的超滤膜进行超滤，得到不同分子量的土鳖虫活性小肽组分，低温减压浓缩（65 ℃，-0.07~-0.08 MPa）后进行冻干得不同分子量土鳖虫活性小肽冻干粉（P1：M < 1 KDa，P2：1 KDa<M<3 KDa，P3：M>3 KDa），灭菌后-20 ℃低温保存。

2.2 总肽含量测定 2.2.1 溶液的配制

对照品溶液的制备：精密称定牛血清白蛋白对照品适量，加水制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。

土鳖虫活性小肽溶液的制备：分别取土鳖虫活性小肽冻干粉（P1：6.45 mg、P2：3.12 mg、P3：6.35 mg），用纯净水定容至25 mL容量瓶中，摇匀，制得P1样品溶液、P2样品溶液、P3样品溶液。

2.2.2 测定方法

按照文献采用福林酚比色法测定总肽含量^[6]，依次测定对照品及P1样品溶液、P2样品溶液、P3样品溶液的吸光度，绘制标准曲线，得回归方程为：Y=0.482 5X+0.029 7（r²=0.997 6），并计算不同分子量土鳖虫活性小肽的总肽含量。结果见表 1。

实验结果得出，3种不同土鳖虫溶液中，均含有活性肽，其中P2溶液中含肽量最高，占总质量的70.84%，P1溶液中含肽量最少，占总质量的40.13%。

2.3 不同分子量土鳖虫活性小肽凝胶体外透皮特性研究 2.3.1 土鳖虫活性小肽凝胶的制备

凝胶基质配方：卡波姆940，30 g（提前加入蒸馏水中充分溶胀成1%的溶液），丙三醇4 g，土鳖虫活性小肽0.2 g，蒸馏水15 mL，氮酮1 g，三乙醇胺0.1 g，共计50 g。

不同凝胶样品制备：将不同分子量的土鳖虫活性小肽P1、P2、P3溶于15 mL蒸馏水中，加入充分溶胀的卡波姆溶液，混匀，依次加入甘油、氮酮，边搅拌边滴加三乙醇胺至凝胶pH为7左右^[7]，即得土鳖虫活性小肽P1凝胶样品、P2凝胶样品、P3凝胶样品。

离体鼠皮制备：取SD大鼠，断颈处死，立即剥离大鼠腹部及背部皮肤，用8%硫化钠溶液脱毛，并小心剔除多余皮下组织，再用生理盐水清洗干净，于4 ℃保存备用，1周内用完。实验前检查皮肤的完整度，避免破损。

2.3.2 透皮扩散实验方法

将处理好的皮肤固定于Franz扩散池，供给池与接收池之间，角质层面向供给池，接收池注满生理盐水并排净气泡，取1 g凝胶均匀涂布于鼠皮上，300 r/min，37 ℃保温开始计时，分别于1、2、4、6、8、10、12、24 h，取出全部接收液并立即补加等量的接收液，接收液浓缩至1.5 mL，再进行肽含量测定^[8-10]。其中，接收池体积为15 mL，有效透过面积为3.14 cm²。

式中Q为累积渗透率，C_n为t时接收液肽浓度，V为接收液体积，m₀为凝胶含有的初始肽量。以累积渗透率Q（%）对时间t（h）作图，得累计透皮曲线。

2.3.3 土鳖虫活性小肽水溶液与凝胶剂透皮性比较

按照2.3.1项下方法分别制备P1、P2、P3凝胶样品，并制备等浓度的小肽水溶液样品，采用上述透皮扩散实验方法，比较P1、P2、P3水溶液与凝胶剂在大鼠皮肤中的渗透性。结果见表 2。

结果表明，P1、P2、P3凝胶剂在大鼠皮肤中的渗透效果均优于水溶液，透皮吸收率均明显提高，说明将土鳖虫活性小肽制成凝胶剂型有利于提高其渗透性，由于凝胶基质中含有氮酮等促渗剂成分，因此渗透性要比水溶液好很多。

2.4 体外透皮扩散实验 2.4.1 不同大鼠皮部位对土鳖虫活性小肽P1凝胶剂透皮性的影响

按照2.3.1项下方法制备土鳖虫活性小肽P1凝胶样品，并按2.3.1项下方法制备大鼠腹部及背部皮肤，采用上述透皮扩散实验方法，比较小肽P1凝胶在大鼠不同皮肤部位中的渗透性，结果见表 3。

结果表明，背部皮肤累计渗透率为54.03%，明显小于腹部皮肤96.19%，单位面积渗透量腹部是背部的1.74倍，因此，实验选择大鼠腹部皮肤进行体外透皮实验。

2.4.2 不同促渗剂对土鳖虫活性小肽P1凝胶剂透皮性的影响

按照2.3.1项下方法分别制备含3%氮酮、3%PEG400、3%油酸不同促渗剂的小肽P1凝胶样品，采用上述透皮扩散实验方法，比较同浓度不同促渗剂对P1凝胶在大鼠皮肤中渗透性差异。结果见表 4。

结果表明，3种不同促渗剂对P1的渗透效果：氮酮>油酸>PEG400，且氮酮的单位面积渗透量分别是PEG400、油酸的1.77倍、1.54倍，说明氮酮的促渗效果更好，这可能与氮酮对皮肤的作用机制有关，它在细胞间类脂膜双分子层结构中发生作用，使其致密性降低，流动性增加^[11]。

2.4.3 不同浓度氮酮对土鳖虫活性小肽P1凝胶剂透皮性的影响

按照2.3.1项下方法分别制备含1%氮酮、3%氮酮、5%氮酮小肽P1凝胶样品，采用上述透皮扩散实验方法，比较不同浓度氮酮对P1凝胶渗透性的影响。结果见表 5。

结果表明，3种浓度的氮酮对土鳖虫活性小肽的促渗作用基本无区别^[12]，选取1%氮酮作为渗透剂即可满足实验要求。

3 讨论

通过本实验，采用酶解方法和超滤法得到3种不同分子量的物质，分别为P1、P2、P3。同时folin肽含量测定方法对3种物质进行肽含量测定，得出含肽量顺序为P2>P3>P1。但是通过对比P1、P2、P3凝胶及其水溶液的累计渗透率，得出分子量越小的透皮性越好，即P1凝胶透皮效果最佳。并通过不同大鼠皮肤透过实验，得出P1凝胶在大鼠腹部皮肤透皮效果更好，P1凝胶累计渗透率可达94.26%。通过对比含3%氮酮、3%PEG400、3%油酸不同促渗剂的小肽P1凝胶样品，3%氮酮对P1凝胶样品促渗作用更强，累计渗透率达96.43%。同时对比含1%氮酮、3%氮酮、5%氮酮小肽P1凝胶样品，最后得出不同浓度氮酮对P1凝胶渗透性影响差异不大。

根据人体皮肤吸收原理，分子量越小的物质越易被皮肤吸收，本实验得出土鳖虫活性小肽3种物质中的P1透皮效果优于其他两种物质，佐证了这一吸收原理，但是土鳖虫活性小肽P1组分中可能含有游离氨基酸，氨基酸分子量小，易被人体皮肤吸收，这可能是造成P1组分透皮吸收率高的原因之一。后期实验需对P1组分进行进一步纯化，去除游离氨基酸后再进行透皮实验。