锦灯笼为茄科植物酸浆[Physalis alkekengi L. var.franchetii（Mast.）Makino]的干燥宿萼或带果实的宿萼。2015版《中国药典》收载，具有清热解毒，利咽化痰等功效，主要用于咽痛音哑、痰热咳嗽等症状，是常用的清热解毒药^[1]。现代药理学的实验结果表明，锦灯笼具有抗炎的作用^[2-4]。然而炎症发生的发病原因和发病机制比较复杂，而中药锦灯笼的化学成分复杂，目前对锦灯笼抗炎作用机制尚未完全阐明。通过网络药理学的研究理念，借助网络分析方法筛选锦灯笼中的活性成分，并构建药物分子靶点-疾病之间的相互作用关系，实现活性成分与机体内靶点及效应分子的完美对接，系统解析并可视化中药多成分-多靶点-多通路的相互作用关系，为更全面的研究中药的药理作用、作用机制及拓展新适应症提供新的思路^[5-6]。

1 材料与方法 1.1 锦灯笼活性成分的筛选及sdf-mol格式的建立

通过中药系统药理学分析平台TcmSP、TCM-PTD和TCM Database@Taiwan^[7]数据库，分别检索锦灯笼的化学成分，根据里宾斯基五原则结合口服吸收利用度（OB）≥30%，类似药（DL）≥0.18与相关文献中报道的成分结合，将收集到小分子化合物最终统一标准到TcmSP数据库。从CAS数据库中确定活性成分的化学结构，在Chembiodraw Ultra 12.0软件中画出各自的结构图。

1.2 潜在作用靶点反向预测

登陆PharmMapper平台，上传锦灯笼活性成分，采用反向分子对接技术，以活性小分子为探针，搜寻其活性成分潜在的作用靶点，匹配结果根据z'-score排序，取前30名（10%），并使用Uniprot数据库对蛋白分子名称进行校正。在药物信息数据库TTD和DrugBank数据库中通过炎症检索相关靶点并筛选，与反向预测的靶点进行对比分析，归纳总结出锦灯笼活性成分抗炎作用的潜在靶点。

1.3 靶点通路注释分析

通过MAS 3.0生物分子功能注释系统将获得的锦灯笼活性成分抗炎作用的潜在靶点信息进行GO富集分析和KEGG通路注释分析，锦灯笼对应的靶蛋白（基因）直接映射到通路上，则靶点富集的通路确定为药物活性成分对代谢通路的信号调控发挥药效的途径。

1.4 锦灯笼活性成分-靶点-通路-疾病网络构建

采用Cytoscape 3.4.0分析软件的匹配功能，将预测的锦灯笼抗炎作用靶点导入，建立锦灯笼活性成分-靶点-代谢通路-疾病作用网络，网络中节点代表锦灯笼活性成分、靶点、代谢通路和疾病，当活性成分的作用靶点能对接到作用通路的靶点时则以边的形式相连，即为锦灯笼中的某个活性成分或多个活性成分作用在同一作用靶点（通路）或多个靶点（通路）。通过构建网络，分析锦灯笼抗炎作用多成分、多靶点、多通路的作用机制。

2 结果 2.1 锦灯笼活性成分的筛选

在中药系统药理学分析平台TcmSP、TCM-PTD和TCM Database@Taiwan数据库检索到锦灯笼活性小分子，通过筛选结果发现文献报道^[8-9]中锦灯笼的主要药效成分（如酸浆苦素等）被过滤掉，考虑到目标化合物的选取原则，首先必须为锦灯笼的主要成分，最终确定锦灯笼的活性成分54个。平均相对分子质量为284.48，氢键给体数目均值为0.84，氢键受体数目均值为2.0，见表 1。

2.2 潜在作用靶点反向预测

通过PharmMapper平台收集到的潜在作用靶点，匹配结果根据z'-score排序，取前30名（10%）与TTD和DrugBank数据库中检索到的抗炎作用相关靶点对比分析，归纳总结出12个可能与锦灯笼抗炎作用相关的潜在作用靶点（蛋白或基因）。通过预测靶点的频次发现, 在细胞过程中发挥重要作用的促分裂素原活化激酶14（MAPK14）、血清白和核受体Rora（RORA）等是锦灯笼主要活性成分潜在靶点蛋白群，MAPK14、白蛋白（ALB）和RORA等是其潜在靶点基因群，见表 2。

2.3 靶点通路注释分析

将锦灯笼活性成分预测出的12个作用靶点信息导入MAS.3.0生物分子功能注释系统，通过通路注释和分析对靶点所在的通路进行富集并整合各个通路中靶点富集程度，得到三条富集分支：生物过程、分子功能和细胞组分。通过GO分析探讨锦灯笼预测靶点的功能分布，图 1为锦灯笼抗炎作用预测靶点的GO分析结果。其中预测靶点在生物过程中signal transduction、proteolysis、metabolism排列靠前；在分子功能中zinc ion binding、protein binding比例最大；在细胞组分中bind（cytoplasm、cytosol、extracellular region、nucleus）关系密切，见图 1。通过KEGG分析探讨锦灯笼抗炎作用预测靶点的通路分布，见图 2。其中12个靶点参与的通路富集有GnRH signaling pathway、Leukocyte transendothelial migration、PPAR signaling pathway、Epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection、VEGF signaling pathway MAPK signaling pathway等16条，预测为锦灯笼抗炎活性成分潜在作用代谢通路。

2.4 锦灯笼活性成分-靶点-通路-疾病网络构建

将MAS.3.0通路注释得到的数据，通过Cytoscape3.4.0软件构建锦灯笼活性成分作用靶点代谢通路-疾病网络模型，如图 3所示。Network Analyzer结果显示，网络节点为86，网络密度为0.043，网络直径为6，网络半径为4，网络中心度为0.354、网络异质性：1.362，最短路径为6 642，特征路径长度为3.023，平均网络度为3.628。如图 3所示，从成分、靶点、通路的富集程度结合中节点网络度分析，Cycloartanol、Cetene、Physalin D、Obtusifoliol、Beta-sitosterol、luteolin等甾体、甾醇、黄酮类化合物为锦灯笼抗炎的主要活性成分；MAPK14、ALB、RORA等为主要的潜在靶点基因；Leukocyte transendothelial migration、GnRH signaling pathway为主要的代谢通路。锦灯笼中Physalin B、Physalin D、Beta-sitosterol、Obtusifoliol等24种成分作用于MAPK14靶点基因上，且MAPK14靶点基因作用于GnRH信号通路、白细胞跨内皮迁移等9条代谢通路，同时Physalin D还作用于HSP90AA1、MMP2、MMP8、NR3C1靶点上，说明锦灯笼中存在不同活性成分共同作用同一靶点的现象，也存在一个化合物与多个靶点之间的作用关系，靶点与通路的关系同成分与靶点，体现了锦灯笼多成分-多靶点-多通路相互协调、共同调节药物作用机制。

3 讨论

研究采用“反向分子对接”的方法虚拟筛选成分，结合DrugBank和TTD抗炎作用分析发现12个锦灯笼抗炎相关靶点, 并对靶点进行GO富集分析和KEGG通路注释分析, 确定16条生物过程的代谢通路，主要参与转录调控、一氧化氮生物合成的正调控、新陈代谢、蛋白水解等生物过程，与人体应激反应、脂质代谢、类固醇代谢等生命活动密切相关，从而发挥抗炎效果^[10]。本研究预测锦灯笼主要活性成分-靶点-通路-疾病的网络中, 从化合物的网络特征来看54个活性小分子中节点网络度大于2的有38个化合物，其中包括Luteolin、β-sitosterol等甾体、甾醇、黄酮类化合物。Chen等^[11]研究发现Luteolin可以减少脂多糖（LPS）激活的巨噬细胞MH-S细胞产生的促炎因子（TNF-α、IL-6）和炎症介质NO、PGE2发挥抗炎活性。Luteolin在一定程度上与非甾体抗炎药的作用机制重合，更有研究表明Luteolin可通过影响Toll-like receptor signaling pathway下调免疫细胞中的NF-κB因子的活性，剂量依赖性的抑制LPS激活的小胶质细胞中的促炎症标记物的表达，从而抑制炎症介质的活动，达到抗炎的效果^[12]。网络模型中的预测结果显示，锦灯笼可能主要通过MAPK14、MMP2等靶点调节发挥抗炎作用，而MAPK14是介导信号转换与传递的重要蛋白，最初被认为是活化的免疫细胞巨噬细胞中检测到的酪氨酸磷酸化蛋白，在炎症细胞因子诱导中起重要作用，参与多种类型细胞的存活、凋亡、增殖分化过程，以及对环境的应激适应、炎症反应等生理过程^[13]。结果中，MAPK14作用在Toll-like receptor signaling pathway、T cell receptor signaling pathway、Epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection等9条代谢通路，目前已经证实，MAPK14可通过作用激活的TLR4信号转导调节视网膜母细胞瘤蛋白。MMP2参与正常生理过程中的细胞外基质的破坏，可以通过炎症介质参与炎症反应并进行调节，也可通过促进VEGF动员和产生抗血管生成因子在肿瘤内血管生成中起重要作用^[14-15]。PPARG在哺乳动物脂肪形成中起重要作用，通过作用于过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）调节脂质代谢，用于治疗肥胖症，动脉粥样硬化等症状^[16]。总之，抗炎作用结合位点与锦灯笼干预靶点能体现在相同的分子网络和细胞信号转导通路上，通过成分与靶点及通路的相互作用，进而影响整个网络的生物学功能，这也许就是锦灯笼抗炎作用的分子作用机制之一。