牛黄清感胶囊是由黄芩、金银花、连翘、人工牛黄、珍珠母等5味药材组成，具有疏风解表、清热解毒的功效，用于外感风寒所致的感冒发热，咳嗽，咽痛^[1]。研究发现其对甲型H3N2流感病毒具有抑制和预防的作用，对呼吸道合胞病毒（RSV）具有极强的预防作用，并且具有较好的临床疗效^[2-3]，为了更好的把控制剂质量，尤其是加强黄芪，金银花，连翘主要药味的质量控制。笔者建立了牛黄清感胶囊的HLPC法同时测定牛黄清感胶囊中8种成分的含量测定^[4-9]，从而对牛黄清感胶囊进行更全面的质量控制^[10]。

1 仪器与试剂 1.1 仪器

Waters Alliance 2695系统，含四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱以及Waters Empower色谱工作站，Waters二极管阵列检测器（PDA 996）；Agilent C₁₈（2）100A（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱。

1.2 试剂与样品

绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸C、连翘酯苷A、汉黄芩苷、汉黄芩素对照品（批号分别为L-007-160504、Y-067-160715，Y-070-161102、L-012-160603、H-019-161031、H-029-140729，均来自成都瑞芬思生物科技有限公司），黄芩苷对照品（批号110715-201016，中国食品药品检定研究院），黄芩素对照品（批号111595-200905，中国食品药品检定研究院），甲醇、乙腈为色谱纯（Merck公司），磷酸为分析纯，水为超纯水；黄芩、连翘及金银花药材购于哈药集团世一堂中药饮片有限责任公司；牛黄清感胶囊由黑龙江奥利达奈德制药有限公司（批号为17010301，17010302，17020301，17020303，17030303）。

2 实验方法 2.1 供试品的制备

取牛黄清感胶囊内容物3 g，精密称定，加甲醇25 mL，超声处理（功率250 W，频率33 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀滤过，取续滤液，即得。

2.2 液相色谱条件

Agilent C₁₈（2）100A色谱柱：（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.5%磷酸溶液（B）进行梯度洗脱，0~5 min，5%A~5%A，5~15 min，5%A~10%A，15~20 min，10%A~14%A，20~50 min，14%A~18%A，50~70 min，18%A~25%A，70~85 min，25%A~30%A，85~110 min，30%A~50%A，体积流量1 mL/min检测波长350 nm，柱温40 ℃。理论板数按绿原酸峰计算应不低于2 000。对照品溶液、样品溶液及各阴性样品溶液见图 1-3。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取绿原酸，隐绿原酸，异绿原酸C，连翘酯苷A，黄芩苷，黄芩素，汉黄芩苷和汉黄芩素对照品适量，加甲醇溶解，分别制成绿原酸300 μg/mL、隐绿原酸200 μg/mL、异绿原酸C 206 μg/mL、连翘脂苷A 203 μg/mL、黄芩苷204 μg/mL、黄芩素203 μg/mL、汉黄芩苷200 μg/mL、汉黄芩素206 μg/mL的溶液，作为对照品溶液。

2.4 方法学考察 2.4.1 精密度实验

取牛黄清感胶囊样品（批号17030303），按“2.3”项方法制备对照品溶液，精密吸取对照品溶液10 μL，重复进样6次，记录色谱图。计算8个色谱峰的峰面积及保留时间，结果表明8个对照品色谱峰面积及保留时间的RSD均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性实验

取牛黄清感胶囊样品（批号17030303），分别于制备后0、2、4、8、12、24 h进样，共记录6个时间点的图谱。结果色谱峰面积的RSD小于2.0%。结果表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性实验

取牛黄清感胶囊样品（批号17030303），按“2.1供试品溶液的制备”项下平行制备6份供试品溶液，依法测定8个色谱峰的峰面积，结果峰面积的RSD小于2.0%。结果表明该方法重复性良好。

2.4.4 加样回收率实验

精密称取“2.1”项已测知含量样品约1.5 g，分别加入一定量的绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸C、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、连翘、对照品，按照“2.1”项下方法制备供试溶液，进样10 μL进行测定，结果绿原酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、连翘酯苷A的平均回收率分别为99.6%、99.3%、100.5%、100.2%、99.6%、100.7%、99.5%、99.2%。

2.4.5 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液1、3、5、10、15、20 μL进样测定；以峰面积（）为纵坐标，进样量（X）为横坐标进行线性回归，得隐绿原酸，绿原酸，异绿原酸C，连翘酯苷A，黄芩苷，黄芩素，汉黄芩苷和汉黄芩素苷的线性回归方程见表 1。

2.4.6 阴性样品溶液的制备

按2015年版《中华人民共和国药典》规定的牛黄清感胶囊制备方法分别制备缺少金银花、黄芩、连翘的阴性样品，按“2.1”项方法操作，即得阴性样品溶液。

3 样品含量的测定

取5批样品按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，以外标法计算待测成分含量见表 2，结果表明绿原酸，隐绿原酸，异绿原酸C，连翘酯苷A，黄芩苷，汉黄芩苷、黄芩素的含量均值分别为1.139、2.793、2.631、31.695、93.123、1.903、0.440、0.305 mg/g。

4 讨论

本实验在流动相选择时，以甲醇-0.1%冰醋酸溶液、甲醇-0.5%磷酸溶液、乙腈-0.5%磷酸溶液等3种流动相系统分别进行试验，其中，乙腈-0.5%磷酸溶液分离效果最好。波长在254 nm条件下，黄芩苷峰过大，不易分开，波长350 nm下各峰比例良好，峰与峰间距良好，易于分辨，故确定350 nm为最佳测定波长。为保持色谱分析的一致性，设定柱温来控制不同实验环境下的色谱分析，分别考察了25、30、35、40 ℃柱温下的分离情况，结果表明，柱温40 ℃时分离效果较好。最终，建立牛黄清感胶囊的HLPC法同时测定牛黄清感胶囊中8个成分的含量。不同流动相的色谱图。

5 结论

中药含量测定^[11-16]是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。

本实验建立了HLPC法同时测定牛黄清感胶囊中8种有效成分的含量的测定方法。通过对精密度、稳定性、重复性、加样回收率、线性关系和阴性样品溶液的制备等方法学的考察，证明了通过对照品，对图谱中的一些峰进行定性定量分析，可以较为全面的反映了牛黄清感胶囊物质基础，为牛黄清感胶囊质量控制提供了依据。