升麻葛根汤，方出自宋代阎孝忠的《阎氏小儿方论》，又名平血饮，后被收录于《太平惠民和剂局方》中，是方剂学“辛凉解表剂”的代表方。原方组成为：升麻2 g，葛根3 g，白芍2 g，炙甘草2 g。用法：研成粗末，每服三钱（9 g），水一盏半，煎取一中盏，去滓。具有解肌透疹、辛凉解毒的功效。主治：麻疹初期，疹发不出，身热头痛，咳嗽，目赤流泪，口渴，舌红、苔薄而干，脉浮数^[1]。升麻性甘、辛，微寒，归肺、脾、胃、大肠经，具有发表透疹，淸热解毒，升举阳气的功效，为君药；葛根性甘、辛，凉，归脾、胃、肺经，为臣药，与君药升麻合用辛能达表，为透疹解肌之要药；白芍性味苦、酸，微寒，归肝、脾经，养血调经，敛阴止汗，柔肝止痛，平抑肝阳为佐药；炙甘草性味甘，平，归心、肺、脾、胃经，补脾和胃，益气复脉，调和药性，为佐使药^[2]。临床升麻葛根汤主要用于治疗乙型、丙型病毒性肝炎、药物性肝病、耳鼻喉科疾病、痘疹未发，或发而不畅等病症^[3-9]。

现代药理学研究表明，升麻中有机酸类成分主要有阿魏酸、异阿魏酸，具有抗炎、阵痛的功效^[10-12]，并以阿魏酸、异阿魏酸为指标控制其质量^[13]；异黄酮类化合物是葛根的主要活性成分，主要有葛根素、大豆苷、大豆苷元等，其中葛根素是葛根特有成分^[14]；白芍中主要含有成分为芍药总苷（TGP），包括芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷等^[15]。TGP具有抗炎、抗溃疡、抗病毒、免疫抑制等多种药理作用，对于类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等疾病有确切的治疗作用^[16-17]。本实验建立了液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）的方法测定犬血浆中异阿魏酸、葛根素、芍药苷的血药浓度，并对犬灌胃给予升麻葛根汤颗粒后异阿魏酸、葛根素、芍药苷的药代动力学进行了研究。

1 材料 1.1 仪器与试药

液质联用仪（美国Agilent公司，包括1290型高效液相色谱仪、6460型三重四级杆质谱仪，MassHunter工作站）；XW-80A型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；XP205型十万分之一天平（METTLER TOLEDO）；ST16R型通用台式离心机（美国Thermo公司）。

升麻葛根汤颗粒（批号160503，由深圳华润三九医药股份有限公司提供）；异阿魏酸（批号111698-201103，含量以99.2%计，中国食品药品检定研究院）；葛根素（批号110752-201514，含量以95.5%计，中国食品药品检定研究院）；芍药苷（批号110736-201539，含量以96.4%计，中国食品药品检定研究院）；甲苯磺丁脲（批号20160802，Sigma公司）；甲醇、乙腈均为色谱纯（购自Fisher Scientific公司）；甲酸为色谱纯（购自Fluka公司）。

1.2 实验动物

Beagle犬，雌雄各半，体质量10~12 kg，由沈阳军区总院实验动物科提供，许可证号：syxk（军）2012-0022。

2 方法 2.1 标准品溶液的配制

精密称取对照品约5.0 mg，加甲醇溶解定容于25 mL量瓶中，得浓度为200 μg/mL的标准品溶液，4 ℃低温保存备用。

2.2 混标溶液的配制

精密移取各对照品1 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇定溶至刻度，摇晃均匀，得浓度为20 μg/mL的混标溶液，4 ℃低温保存备用。

2.3 内标溶液的配制

精密称取甲苯磺丁脲对照品约5.0 mg，加甲醇定容于25 mL量瓶中，得浓度为200 μg/mL的内标溶液，4 ℃低温保存备用。

2.4 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC^® BEH C₁₈柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美国Waters公司）；柱温：25 ℃；流速：0.2 mL/min；进样量：5 μL；检测波长：320 nm；流动相：0.05%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脱（0~2 min，5%B~70%B；2~4.5 min，70%B~100%B；4.5~5.5 min，100%B~100%B；5.5~6 min，100%B~100%B；6~7 min，5%B~5%B）。

2.5 质谱条件

离子源：采用电喷雾离子源（ESI源）；检测方式：负离子检测；扫描方式：多反应离子监测（MRM）；干燥气：N₂；干燥气温度：350 ℃；干燥气流量：11 L/min；雾化气压力：15 psi；毛细管电压：3 500 V，具体参数见表 1。

2.6 血浆样品处理方法

取200 μL血浆加入100 μL内标溶液（甲苯磺丁脲2 μg/mL），加入乙腈1 mL，涡旋5 min，10 000 r/min离心5 min，取1 mL上清液，氮气吹干。加入200 μL甲醇复溶，涡旋5 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液进LC-MS/MS分析。

2.7 所用软件（版本）及统计分析方法

使用WinNonlin6.4软件的非房室模型计算方法计算药代动力学参数。

3 结果 3.1 专属性

分别取空白血浆、空白血浆加标准品和血浆样品，按照“血浆样品处理方法”处理后进样。结果表明，血浆中的内源性物质不干扰测定。见图 1。

3.2 标准曲线

取混合标准品溶液200 μL，氮气吹干，加入空白血浆200 μL，使芍药苷浓度为4 144、2 072、1 036、518、207.2、103.6、51.8、10.36 ng/mL，葛根素浓度为4 160、2 080、1 040、520、208、104、52、10.4 ng/mL，异阿魏酸浓度为4 240、2 120、1 060、530、212、106、53、10.6 ng/mL，按照“血浆样品处理方法”处理后进样，建立标准曲线。以待测物浓度（ng/mL）为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权（W=1/x）法进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线。异阿魏酸回归方程为=9.487 6X+5.2574，r²=0.998 9；葛根素回归方程为=2.871 4X+4.405 9，r²=0.998 7；芍药苷回归方程为=4.484 9X-2.992 0，r²=0.995 6。

3.3 提取回收率

取200 μL混标，氮气吹干，按“血浆样品处理方法”项下的方法分别制备低、中、高3个浓度的质量控制（QC）样品（n=6），所得样品浓度与除用混标复溶，按“血浆样品处理方法”项下的方法分别制备低、中、高3个浓度的质量控制（QC）样品（n=6）浓度相比，测定提取回收率。结果显示该方法的提取回收率均在61.55%±（1.06~81.71）%±2.82之间，RSD＜15%符合生物样品测定要求，结果见表 2。

3.4 基质效应

取空白血浆200 μL，除去用混标复溶外，按“血浆样品处理方法”项下的方法分别制备低、中、高3个浓度的质量控制（QC）样品（n=6），所得的峰面积与标准品溶液直接进样所得峰面积相比，测定基质效应，结果显示不存在明显的基质效应，结果见表 2。

3.5 精密度及准确度

取空白血浆200 μL，按“血浆样品处理方法”项下的方法分别制备低、中、高3个浓度的质量控制（QC）样品（n=6），在同日内用同一条标准曲线进行处理、分析，得到日内精密度RSD、日间精密度RSD和准确度RE。结果表明4个化合物日内精密度RSD＜15%、日间精密度RSD＜15%，准确度偏差RE值均在±15%以内，均符合目前生物样品分析方法指导原则的有关规定，结果见表 3。

3.6 稳定性

取空白血浆200 μL，按“血浆样品处理方法”项下的方法分别制备低、中、高3个浓度的质量控制（QC）样品（n=6），考察样品在室温放置24 h（short-term stability）、-20 ℃反复冻融3次（freeze-thaw stability）、-20 ℃冻融30 d（long-term stability）。结果显示4个化合稳定性RE值均在±15%以内，表明芍药苷、葛根素、异阿魏酸在上述条件下可保持稳定，结果见表 4。

3.7 药动学研究

取受试犬6只，给药前禁食12 h，自由饮水。灌胃给予升麻葛根汤颗粒，剂量9 g/只（成人一天给药剂量为9 g）。于给药前0 h及给药后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10、12、24 h取犬前腿静脉血2.5 mL，置肝素离心管中，3 000 r/min离心10 min，分离血浆至试管中，-80 ℃冷冻待测，作为血浆样品。测定时，取样品血浆按“2.6”项下方法处理，进样测定血药浓度，并计算芍药苷、葛根素、异阿魏酸的血药浓度，绘制平均药时曲线，结果见图 2。

4 讨论

本实验对血浆样品中3种成分的提取方法进行了考察：甲醇沉淀、乙腈沉淀、乙酸乙酯提取、叔丁基甲醚提取，结果发现乙睛沉淀无内源性物质干扰，重现性好，可达实验测定要求。考察了不同比例甲醇-甲酸水、乙睛-甲酸水及乙睛-甲酸铵、乙睛-乙酸铵作为流动相，发现本实验所建立的流动相梯度洗脱程序能有效地将3个成分和内源性成分分离。

HPLC法同时检测异阿魏酸、葛根素、芍药苷的含量及指纹图谱文献多有报道^[18-21]，单个化合物的药代动力学也有较多文献研究^[22-24]，但是3种化合物同时检测未见报道。本文以甲苯磺丁脲为内标物质，采用LC-MS/MS建立了犬灌胃给予中药复方“升麻葛根汤”颗粒后血浆中异阿魏酸、葛根素、芍药苷的含量测定方法，为升麻葛根汤颗粒的质量控制及药理作用研究提供了依据。芍药苷属于苷类、中性化合物，正负离子检测模式均可，本实验通过条件优化结果比较可知，负离子检测模式较好，适合芍药苷的体内分析及药动学研究，具有较好的参考价值。该方法具有较高的专属性、灵敏度，且提取回收率和基质效应、精密度与准确度、稳定性均符合生物样品测定要求。