膝骨关节炎(KOA)是骨伤科的常见疾病之一，其主要病理表现包括软骨的退行性改变、滑膜的炎症反应、关节间隙狭窄和继发性骨质增生，该病发病率高，在老年人群中更高达每年240/10万^[1]，对患者及其家属生活质量造成严重的影响。近年来国内外研究发现，TLRs/MyD88信号通路与KOA病程进展有着紧密的关系，该通路上的相关原件Toll样受体(TLR)4、NF-κB、MyD88是TLR家族重要成员，在促炎症因子、基质金属蛋白酶等导致的骨关节炎软骨退变病理进程中起重要的介导作用，对软骨细胞凋亡、细胞外基质代谢失衡具有关键作用。因此，推测该通路及其相关原件是干预KOA滑膜炎症的症的重要作用靶点。通络止痛处方是笔者导师凭借多年临床治疗KOA的经验总结而成的中医外治方剂，具有活血化瘀，通络止痛的功效，通过中药外敷或超声促透等给药方式可以避免首过效应，增加局部浓度，提高疗效。本研究应用超声促透通络止痛方对差异KOA病程的滑膜及软骨的组织学评估及上述通路上重要蛋白的免疫荧光分析，探讨通络止痛方通过调控TLRs/MyD88信号通路对膝骨关节炎滑膜炎症的作用机制。

1 材料与方法 1.1 动物

采用中国中医科学院医学实验中心购买的雄性8周龄Wistar大鼠90只，体质量(0.20±0.01)kg。

1.2 实验试剂与仪器

多聚甲醛、DAPI染色液、及石蜡、苏木素-伊红染色剂(HE)、无水乙醇、梯度酒精由，北京百诺威生物科技有限公司提供提供；低频超声波发生仪、中药萃取液，北京诺亚同舟医疗技术有限公司。

1.3 动物分组

大鼠单侧KOA模型，分为造模2、4、8周组，每组30只；2、4、8周组每组又随机分为3组每组10只，其中10只超声促透通络止痛方干预，10只通过超声促透生理盐水干预，另10只不做任何处理。2、4、8周组大鼠模型分别在造模后2、4、8周后给药，1次/天，持续给药一周后取材。超声促透参数：超声频率：30 KHz，功率30 W，透入速率：40~60 μg，每次耗时15 min。超声探头要垂直于皮肤表面，液体和皮肤需紧密接触。

1.4 KOA大鼠模型制备与样本收集

采用经典Hulth法造成造模，造模后给与青霉素注射预防感染，常规颗粒饲料与饮用水饲养。该动物研究经北京中医药大学动物实验伦理委员会审批。2、4、8周组在干预后分别对各组大鼠手术取材，取材部位为膝关节股骨髁(包含软骨及软骨下骨)和滑膜组织，标号后放置液氮中备用。

1.5 检测内容

常规石蜡包埋切片，HE染色法染色后，利用Mankin’s评分对干预后KOA病变程度及各阶段软骨组织学进行分级评估。双标的免疫荧光染色检测干预后各组样本滑膜组织中TLR4、MyD88和NF-κB的变化。

1.6 统计分析

所有数据录入EXCEL表格，统计分析应用SPSS 20.0软件进行统计学处理, 多组间差异的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)；以P < 0.05有统计学意义。检测数据结果以均数±标准差(x±s)表示。

2 结果 2.1 形态学观察

按各组取材时间要求打开关节腔，2周组中，中药组、盐水组与未干预组软骨颜色、光泽度与透亮度无明显异常，均表现为软骨外观形状无变化，成白色微透明状，表面光泽，无裂纹、软化及充血表现。盐水组与未干预组较中药组的滑膜组织颜色较暗红，略有增生，盐水组与未干预组滑膜情况相似；4周组中，中药组、盐水组与未干预组软骨透亮度均有一定程度下降，颜色渐暗，无溃疡及骨赘形成，盐水组与未干预组软骨状态相似，较中药组出现少许裂隙及软化，盐水组与未干预组较中药组的滑膜组织颜色较暗红，较多增生，盐水组与未干预组滑膜情况相似；8周组中，中药组、盐水组与未干预组软骨暗淡无光泽，透明度消失，中药组软骨有较少量裂纹、溃疡、骨赘、局部软骨软化，股骨内侧髁完整度良好，轻度磨损，盐水组与未干预组软骨状态相似，较中药组有明显局部软骨软化，裂纹，溃疡，骨赘增多，股骨内侧髁磨损严重，失去完整度，中药组滑膜组织增生，充血，盐水组与未干预组滑膜情况相似，较中药组滑膜组织有明显的大量增生，关节腔模糊，滑膜大量充血、水肿。

2.2 组织学观察 2.2.1 软骨的HE染色及组织学评分

根据形态学观察结果，对各组软骨组织片，观察干预前后软骨的病理变化，2周组中，中药组、盐水组与未干预组均表现为正常的软骨生理结构，表面光滑，细胞分层及形态规则，潮线整齐。盐水组与未干预组较中药组细胞数目增多，盐水组与未干预组软骨结构情况相似(见图 1)；4周组中，中药组软骨面略粗糙，偶见表层裂隙，潮线整齐，细胞数目、密度较2周组中药组多，盐水组与未干预组软骨表面粗糙，多处裂隙，潮线偶有中端，细胞数量及密度较中药组大，盐水组与未干预组软骨结构情况相似(图 1D、E、F)；8周组中，中药组较4周组中药组裂隙加深，细胞数量及密度增大，分层尚清晰，潮线多处中断，盐水组与未干预组较中药组裂隙变深、增宽，表面出现较大范围被薄层瘢痕纤维组织覆盖的缺损区，软骨细胞分层不清，潮线完全紊乱或消失，盐水组与未干预组软骨结构情况相似(图 1G、H、I)。

2、4、8各组中，盐水组、未干预组与中药组比较Mankin’s评分均有统计学差异(P < 0.05)，各组中中药组较盐水组与未干预组分值减少(见表 1)。

2.2.2 滑膜的HE染色

2周组中，中药组表现为正常滑膜组织形态，即主要为滑膜细胞组成，滑膜衬里层细胞单层排列，无增生、肥大及间质水肿，叠瓦状规则排列的无基膜包绕的软组织，盐水组与未干预组滑膜结构情况相似，较中药组出现轻度增生，间质水肿(图 2A、B、C)；4周组中，中药组较2周组中药组滑膜细胞增生，局部出现细胞聚集，盐水组与未干预组滑膜结构情况相似，较中药组出现细胞增多、聚集，滑膜衬里层细胞层数增多，间质水肿(图 2D、E、F)；8周组中，中药组较4周组中药组滑膜细胞增多，间质水肿，偶有炎性细胞浸润，盐水组与未干预组滑膜结构情况相似，与中药组相比，排列紊乱，肥大，间质水肿，细胞增生，出现增生血管(图 2G、H、I)。

2.3 免疫荧光双标检测法检测TLR4、MyD88和NF-κB表达及定位的改变

TLR4是一种细胞膜上的跨膜蛋白，具有介导炎性介质释放等特异性生物学效应，在各组的中药组中的表达量较盐水组与未干预组中显著减少，盐水组与未干预组TLR4表达量相似；MyD88是一种在胞质中被检测到的蛋白，在各组的中药组中的表达强度较盐水组与未干预组中表达强度明显减弱，盐水组与未干预组MyD88表达强度相似；NF-κB是一种随KOA病情进展由细胞质至细胞核转移的蛋白，在各组的中药组中，可以在细胞质中检测到NF-κB蛋白，而在盐水组与未干预组的细胞核中可以检测到NF-κB蛋白，见图 3。

3 讨论

通络止痛方是笔者导师凭借多年治疗KOA的经验总结而成，组成包括：桃仁、红花、桂枝、白芍、制草乌头、细辛、川椒、牛膝、乳香、没药。主要功效包括活血化瘀，通络止痛。其中白芍、桂枝为通络止痛汤的君药，桂枝辛甘温，有温通经脉，助阳化气之功效；白芍苦、酸、微寒，有养血敛阴，柔肝止痛之功效。两者合用一敛一散，一补一开，解肌发表，调和营卫，使发汗而不伤阴，气血调而不伤气。两药合用亦可治疗气血不调导致的四肢酸楚、麻木、疼痛等。以桃仁、红花、乳香、没药为臣药，可活血祛瘀、行气止痛、舒筋通络。红花、桃仁为活血化瘀常用药对。红花辛温，主入心、肝经，散瘀止痛。《医学衷中参西录》云：“乳香、没药，二药并用，为宣通脏腑、流通经络之要药……具通气活血之力，又善治风寒湿痹，周身麻木，四肢不遂及一切疮疡肿疼，或其疮硬不疼。”这4味药可加强行气活血化瘀的药力，正所谓“治风先治血，血行风自灭”。制草乌头、细辛为本方的佐药，具有祛风除湿、温经散寒、消肿止痛之效。川椒为为本方的使药，具有活血祛瘀、祛风利湿之效。牛膝“性善下行”，具有良好的引经作用，且有补肝肾，强筋骨之功。全方组成严谨，配伍精湛。

膝骨性关节炎是是以骨质增生和关节软骨退行性改变为主要特征的慢性疾病，伴骨赘形成、软骨下骨变性及滑膜炎症^[2]。研究表明，KOA的病程涉及多种信号通路及免疫细胞等的参与，其中，Toll样受体是以固有免疫系统中一类重要的模式识别受体(PRRs)，广泛参与病原相关分子模式(PAMPs)的识别及内源性危险信号相关分子模式(DAMPs)的感知，进而启动固有免疫应答，防御各种病原体入侵的决定性屏障^[3-4]。Toll样受体活化后可通过一系列反应广泛参与感知DAMPs和识别PAMPs，诱导多种炎性因子和介质的合成与释放，诱发或加重KOA^[5]。最近有研究表明，固有免疫应答在KOA的发生与发展过程中起到关键的作用^[6]

不同的TLR分子与其识别配体结合后形成二聚体复合物，复合物将含TIR的衔接蛋白募集至TIR区与衔接蛋白结合，胞外信号随即进入胞内，启动细胞内的下游级联反应，TLRs与衔接蛋白结合后，主要通过两条途径启动下游一系列级联反应，根据信号传导过程中有无My D88衔接蛋白的参与而分为My D88非依赖途径和My D88依赖途径。除TLR3外所有的TLRs介导的信号通路均可通过My D88依赖途径发挥作用，包括TLR-2在内；而TLR4介导的信号通路则同时存在于这两条单独的信号途径^[7]。而这两种信号传导途径，最终均需激活NF-κB，引起下游细胞因子分泌，即无论哪种信号传导途径，NF-k B都处于下游信号传导过程的中枢地位。

本研究选取了该通路上3个重要的蛋白TLR4、MyD88及NF-κB，应用免疫荧光双标检测法等方法，在超声促透通络止痛方干预后，目标蛋白表达量及定位均有一定的改变，结合形态学及组织学的改变情况，笔者发现，通络止痛方可以通过调控TLRs/MyD88信号通路上重要元件，即TLR4、MyD88及NF-κB，抑制滑膜细胞增生，及炎症反应，减缓软骨退变，对不同程度膝骨性关节炎均有疗效。KOA的病理发展是一个复杂的过程，并非一两个细胞因子作用的结果，但是TLRs/MyD88信号通路有可能成为KOA诊断和治疗的一项有用的指标，并且可能为KOA的治疗提供一个新的靶点。通过通络止痛方干预TLRs/MyD88信号通路或抑制其生物活性，将为治疗骨性关节炎开辟一条新的途径。