通脉养心丸是在《伤寒论》里“炙甘草汤”基础上由天津名老中医董晓初先生改造为院内制剂，后经过天津中医药大学心血管专家阮士怡教授进一步完善的一种中成药^[1]，由地黄、鸡血藤、麦冬、甘草、制何首乌、五味子、党参、桂枝等11味中药组成，具有养心补血，通脉止痛的功效。临床主要用于治疗胸痹心痛、心悸怔忡和气阴两虚型冠心病等病症^[2-5]，并可与β受体阻滞剂联合用药用于治疗心律失常、心绞痛^[6-9]。虽已有文献报道对通脉养心丸中某些化学成分进行了定量研究^[10-11]，但还不足以全面反映通脉养心丸的质量。通脉养心丸成分复杂，因而有必要全面研究其化学成分，以保证其质量的安全有效。

超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS/MS)技术具有“三高”(高效率、高灵敏度、高分辨率)的特点，同时还能得到化合物的分子量、元素组成以及离子碎片等信息，可快速确定化合物的结构。本实验采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对通脉养心丸中的化学成分进行快速、全面地定性分析，最终鉴定出了32个化合物，为通脉养心丸化学成分的研究及其药效成分的确定提供了参考。

1 仪器与试药 1.1 仪器

Agilent 1290超高效液相色谱仪串联Agilent Q-TOF 6520质谱仪(Agilent，USA)；Agilent Mass Hunter分析软件(Agilent，USA)；AX205型十万分之一分析天平(Mettler Toledo，Switzerland)；Milli-Q超纯水仪(天津信睿生物科技有限公司)；5424R型低温高速离心机(eppendorf，Germany)；G3KT18273型微型旋涡混合仪(赛默飞世尔科技有限公司)。ZZ-L6DT超声波清洗机(天津知著科技有限公司)。

1.2 试药

对照品甘草酸(批号：MUST-16070805)、甘草素(批号：MUST-16070805)、异甘草素(批号：MUST-16012503)、二苯乙烯苷(批号：110844-201411)、甘草苷(批号：111610-201106)、大黄素(110756-200110)、毛蕊花糖苷(MUST-17020715)、没食子酸(批号：MUST-16022801)、五味子醇甲(批号：110857-201412)购于成都领航者生物科技有限公司；芒柄花苷(批号：20160512)购于天津士兰科技有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯，购于Fisher公司；无水乙醇(色谱纯)购于康科德科技有限公司。超纯水由Milli-Q超纯水仪(购于天津信睿生物科技有限公司)制备。通脉养心丸购于天津中新药业集团股份有限公司。

2 方法 2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC^®BEH C₁₈柱(2.1×100 mm，1.7 μm)；流动相：0.1%甲酸水(A相)-乙腈(B相)；梯度洗脱，洗脱条件如下：负离子模式下，0~2 min，5%~15% B；2~27 min，15%~55% B；27~30 min，55%~70% B；30~38 min，70%~95% B；38~40 min，95%~95% B；正离子模式下，0~5 min，15%~30% B；5~30 min，30%~65% B；30~38 min，65%~95% B；38~40 min，95%~95% B；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。

2.2 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)，负离子及正离子模式监测，干燥气温度(Gas Temp)：310 ℃；干燥气流速(Gas Flow)：9 L/min；雾化器压力(Nebulizer)：30 psi；裂解电压(Fragmentor)：135 V；碰撞电压(Collision energy)：20 V；扫描范围m/z：0~2 000。

2.3 对照品溶液的制备

分别称取大黄素、二苯乙烯苷、甘草酸、甘草苷、甘草素、异甘草素、芒柄花苷、毛蕊花糖苷、没食子酸和五味子醇甲对照品各2 mg，精密称定，加入甲醇溶解并定容，配制成浓度为1 mg/mL的对照品原液，均于4 ℃冰箱保存待用。

2.4 供试品溶液的制备

将通脉养心丸样品粉碎后研细，精密称取0.2 g置10 mL量瓶中，加50%乙醇稀释至刻度线，超声提取(功率180 W，频率40 KHz)20 min，摇匀，取1 mL该溶液，14 000 r/min离心10 min，取上清溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

3 结果与分析

通脉养心丸样品按照“2.1”和“2.2”所述的色谱和质谱条件进行分析，采集得到通脉养心丸样品在负离子和正离子模式下的总离子流图，见图 1。化合物的鉴定方法为：利用Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis分析软件，分别提取正、负离子模式下采集的样品溶液的总离子流图(TIC)，根据准分子离子峰，确定化合物分子式，有对照品的成分再结合二级质谱碎片与其对照品裂解规律进行比对，无对照品的成分参照相关文献数据比对，共鉴定出了32个化合物，具体鉴定结果见表 1。

化合物1：正离子检测模式下，t_R为5.59 min，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 419.134 2，二级扫描裂解产生特征离子碎片m/z 257.081 2，由元素组成分析，其分子式为C₂₁H₂₂O₉；对照品t_R为5.60 min，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 419.136 5，二级裂解离子碎片m/z 257.080 4[M+H-glucose]⁺。对比对照品鉴定化合物1为甘草苷，来源于甘草。

化合物2：正离子检测模式下，t_R为5.60 min，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 147.044 2，二级扫描裂解产生特征离子碎片，m/z 121.050 9，由元素组成分析，其分子式为C₉H₆O₂。参照文献[12]，相对分子质量为416.143，推测化合物2为香豆素，来源于桂枝。

化合物3：正离子检测模式下，t_R为5.78 min，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 431.131 2，二级扫描裂解产生特征离子碎片m/z 269.078 5，由元素组成分析，其分子式为C₂₂H₂₂O₉；对照品t_R为5.79 min，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 431.134 9，二级裂解离子碎片m/z 269.080 6[M+H-glucose]⁺。对比对照品鉴定化合物3为芒柄花苷，来源于鸡血藤。

化合物4和8：正离子检测模式下，t_R分别为6.31 min和10.09 min，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 257.080 9，二级扫描裂解产生特征离子碎片m/z 137.022 4，由元素组成分析，其分子式为C₁₅H₁₂O₄；对照品t_R分别为6.34 min和10.09 min，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 257.081 9，二级裂解离子碎片m/z 137.022 6[M+H-C₇H₄O₂]⁺。对比对照品鉴定化合物4和8分别为甘草素和异甘草素。

化合物5：正离子检测模式下，t_R为7.97 min，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 985.462 4，二级扫描裂解产生特征离子碎片m/z 823.405 7，由元素组成分析，其分子式为C₄₈H₇₂O₂₁；参照文献[13]，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 985.467 8[M+H-glucose]⁺，推测化合物5为甘草皂苷A3，来源于甘草。

化合物6：正离子检测模式下，t_R为8.08 min，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 285.076 9，二级扫描裂解产生特征离子碎片m/z 121.050 9，由元素组成分析，其分子式为C₁₆H₁₂O₅；参照文献[14]，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 285.071 1，推测化合物6为毛蕊异黄酮，来源于地黄。

化合物7：正离子检测模式下，t_R为9.42 min，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 271.060 7，二级扫描裂解产生特征离子碎片m/z 253.050 2、169.012 3、123.007 3，由元素组成分析，其分子式为C₁₅H₁₀O₅；对照品t_R=9.42 min，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 271.058 8，二级裂解离子碎片253.049 8、169.013 3、123.006 6。对比对照品鉴定化合物7为大黄素，来源于制何首乌。

化合物9：正离子检测模式下，t_R为10.50 min，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 269.081 0，二级扫描裂解产生特征离子碎片m/z 254.057 0、253.049 7、237.054 8、226.061 6、225.056 4、213.090 7和197.060 1，由元素组成分析，其分子式为C₁₆H₁₂O₄；参照文献[15]，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 269.080 6，二级裂解离子碎片m/z 254.055 4[M+H-CH₃]⁺、253.046 2[M+H-CH₃]⁺、237.054 4[M+H-CH₃OH]⁺、226.059 7[M+H-CH₃-CO]⁺、225.052 0[M+H-CO₂]⁺、213.088 7[M+H-2CO]⁺和197.061 2[M+H-CO₂-CO]⁺，推测化合物9为芒柄花黄素，来源于鸡血藤。

化合物10：正离子检测模式下，t_R为12.14 min，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 823.412 7，二级扫描裂解产生特征离子碎片m/z 647.378 1，471.346 4，由元素组成分析，其分子式为C₄₂H₆₂O₁₆；对照品t_R为12.09 min，一级离子化产生[M+H]⁺，m/z 823.403 3，二级裂解碎片m/z 647.373 6[M+H-glucuronide acid]⁺、471.342 5[M+H-2glucuronide acid]⁺。对比对照品鉴定化合物10为甘草酸，来源于甘草。

化合物11：正离子检测模式下，t_R为13.88 min，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 433.224 0，二级扫描裂解产生特征离子碎片m/z 415.211 6，384.1933，369.169 2，由元素组成分析，该化合物的分子式为C₂₄H₃₂O₇；对照品t_R为13.85 min，一级离子化产生[M+H]⁺峰，二级裂解碎片m/z 415.212 8[M+H-H₂O]⁺，384.192 8[M+H-OCH₃]⁺，369.171 4[M+H-OCH₃-CH₃]⁺。对比对照品鉴定化合物11为五味子醇甲，来源于五味子。

化合物12：正离子检测模式下，t_R为15.54 min，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 369.133 8，由元素组成分析，该化合物的分子式为C₂₁H₂₀O₆；参照文献[13, 16]，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 369.131 7，推测化合物12为甘草宁B，来源于甘草。

化合物13：正离子检测模式下，t_R为18.14 min，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 355.117 1，由元素组成分析，其分子式为C₂₀H₁₈O₆；参照文献[17]，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 355.118 0，推测此化合13为甘草宁C，来源于甘草。

化合物14：正离子检测模式下，t_R为18.71 min，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 401.196 9，二级扫描裂解产生特征离子碎片m/z 386.172 4和370.177 0，由元素组成分析，其分子式为C₂₃H₂₈O₆；参照文献[18]，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 401.1966，二级裂解碎片m/z 386.173 0[M+H-CH₃]⁺和370.176 9[M+H-OCH₃]⁺，推测此化合物14为五味子乙素，来源于五味子。

化合物15：正离子检测模式下，t_R为21.52 min，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 383.149 8，二级扫描裂解产生特征离子碎片m/z 369.141 1[M+H-CH₂]⁺，355.142 9[M+H-C₂H₄]⁺，由元素组成分析，其分子式为C₂₂H₂₂O₆；参照文献[17]，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 383.150 4，二级裂解碎片m/z 369[M+H-CH₂]⁺和355，推测化合物15为甘草利酮，来源于甘草。

化合物16：正离子检测模式下，t_R为27.08 min，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 149.062 8，由元素组成分析，该化合物的分子式为C₉H₈O₂；参照文献^[19]，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 149.059 9，推测化合物16为桂皮酸，来源于桂枝。

化合物17：正离子检测模式下，t_R为27.40 min，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 417.228 6，二级扫描裂解产生特征离子碎片m/z 355.145 5，由元素组成分析，其分子式为C₂₃H₂₈O₆；参照文献[18]，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 417.227 4，二级裂解碎片m/z 355.153 7，推测化合物17为五味子甲素，来源于五味子。

化合物18：正离子检测模式下，t_R为27.42 min，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 353.138 9，二级扫描裂解产生特征离子碎片m/z 337.273和297.076，由元素组成分析，其分子式为C₂₁H₂₀O₅；参照文献[17]，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 353.018 6，二级裂解碎片m/z 337[M+H-CH₄]+和297[M+H-C₄H₈]+，推测化合物18为甘草宁A，来源于甘草。

化合物19：正离子检测模式下，t_R为27.74 min，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 385.164 5，二级扫描裂解产生特征离子碎片m/z 353.139 6和330.106 2，由元素组成分析，其分子式为C₂₂H₂₄O₆；参照文献[17]，一级离子化产生[M+H]⁺峰，m/z 385.164 3二级裂解碎片m/z 353.138 1[M+H-OH-CH₄]⁺和330.105 0[M+H-C₄H₇]⁺，推测化合物19为五味子丙素，来源于五味子。

化合物20：负离子检测模式下，t_R为1.76 min，一级离子化产生[M-H]^-峰，m/z 169.014 3，二级扫描裂解产生特征离子碎片m/z 125.024 5，由元素组成分析，其分子式为C₇H₆O₅；对照品t_R为1.75 min，一级离子化产生[M-H]^-峰，m/z 169.014 5，二级裂解碎片m/z 125.024 4[M-H-CO₂]^-。对比对照品鉴定化合物20为没食子酸，来源于制何首乌。

化合物21：负离子检测模式下，t_R为3.51 min，一级离子化产生[M-H]^-峰，m/z 165.055 9，由元素组成分析，其分子式为C₉H₁₀O₃；参照文献[20]，一级离子化产生[M-H]-峰，m/z 165.055 2，推测化合物21为对羟基苯甲酸，来源于甘草。

化合物22：负离子检测模式下，t_R为3.65 min，一级离子化产生[M-H]^-峰，m/z 175.061 4，二级扫描裂解产生特征离子碎片m/z 157.040 0，由元素组成分析，其分子式为C₇H₁₂O₅；参照文献[21]，一级离子化产生[M-H]^-峰m/z 175.058 5，二级裂解碎片m/z 157.049 6[M-H-H₂O]^-，推测化合物22为羟甲基戊二酸，来源于甘草。

化合物23：负离子检测模式下，t_R为5.65 min，一级离子化产生[M-H]^-峰，m/z 577.161 8，二级扫描裂解产生特征离子碎片m/z 549.166 9和119.035 6，由元素组成分析，其分子式为C₂₇H₃₀O₁₄；参照文献[22]，一级离子化产生[M-H]^-峰，m/z 577.155 5，二级裂解碎片m/z 549[M-H-H₂O]^-和119[M-H-C₁₉H₂₂O₁₃]^-，推测化合物23为异佛来心苷，来源于甘草。

化合物24：负离子检测模式下，t_R为6.12 min，一级离子化产生[M-H]^-峰，m/z 549.166 6，二级扫描裂解产生特征离子碎片m/z 254.059 6和119.049 7，由元素组成分析，其分子式为C₂₆H₃₀O₁₃，参照文献^[22]，一级离子化产生[M-H]^-峰，m/z 549.163 4，二级裂解碎片m/z 254.057 9和119.048 8，推测化合物24为甘草己糖，来源于甘草。

化合物25：负离子检测模式下，t_R为6.29 min，一级离子化产生[M-H]^-峰，m/z 405.124 2，二级扫描裂解产生特征离子碎片m/z 243.068 5，由元素组成分析，其分子式为C₂₀H₂₂O₉；对照品t_R为6.29 min，一级离子化产生[M-H]^-峰，m/z 405.122 9，二级裂解碎片m/z 243.067 2[M-H-C₆H₁₀O₅]^-。对比对照品鉴定化合物25为二苯乙烯苷，来源于制何首乌。

化合物26：负离子检测模式下，t_R为6.58 min，一级离子化产生[M-H]^-峰，m/z 623.202 0，二级扫描裂解产生特征离子碎片m/z 461.170 1，161.024 4，由元素组成分析，其分子式为C29H36O15；对照品t_R为6.60 min，一级离子化产生[M-H]^-峰，m/z 623.201 9，二级裂解碎片m/z 461.165 9[M-H-glucose]^-和161.046 2[M-H-C₂₀H₃₀O₁₂]^-。对比对照品鉴定化合物26为毛蕊花糖苷，来源于地黄。

化合物27：负离子检测模式下，t_R为8.30 min，一级离子化产生[M-H]^-峰，m/z 137.024 2，由元素组成分析，其分子式为C₇H₆O₃；参照文献^[23]，一级离子化产生[M-H]^-峰，m/z 137.024 4，推测化合物27为原儿茶醛，来源于鸡血藤。

化合物28：负离子检测模式下，t_R为9.50 min，一级离子化产生[M-H]-峰，m/z 417.123 2，二级扫描裂解产生特征离子碎片m/z 255.0674，213.056 1，由元素组成分析，其分子式为C₂₁H₂₂O₉；参照文献^[20]，一级离子化产生[M-H]^-峰，m/z 417.117 5，二级裂解碎片m/z 255.066 7[M-H-glucose]^-和213.056 1[M-H-C₂H₂O]^-，推测化合物28为何首乌乙素，来源于制何首乌。

化合物29：负离子检测模式下，t_R为10.13 min，一级离子化产生[M-H]^-峰，m/z 651.233 8，由元素组成分析，其分子式为C₃₁H₄₀O₁₅；参照文献[24]，一级离子化产生[M-H]^-峰，m/z 651.230 2，推测化合物29为地黄苷，来源于地黄。

化合物30：负离子检测模式下，t_R为14.77 min，一级离子化产生[M-H]^-峰，m/z 299.059 0，由元素组成分析，其分子式为C₁₆H₁₂O₆；参照文献[20]，一级离子化产生[M-H]^-峰，m/z 29 9.057 8，推测化合物30为8-甲基醚-柠檬香豆素，来源于制何首乌。

化合物31：负离子检测模式下，t_R为16.52 min，一级离子化产生[M-H]^-峰，m/z 837.398 1[M-H]^-，二级扫描裂解产生特征离子碎片m/z 351.060 0，由元素组成分析，其分子式为C₄₂H₆₂O₁₇；[M-H]^-离子的相对质量理论值为837.391 4，参照文献[22]，一级离子化产生[M-H]^-峰，m/z 837.3918，二级裂解碎片m/z 351，推测化合物31为甘草皂苷G2，来源于甘草。

化合物32：负离子检测模式下，t_R为18.44 min，一级离子化产生[M-H]^-峰，m/z 283.063 0，二级扫描裂解产生特征离子碎片m/z 269.077 4和213.870 1，由元素组成分析，其分子式为C₁₆H₁₂O₅；参照文献[20]，一级离子化产生[M-H]^-峰，m/z 283.0612，二级裂解碎片m/z 269.043 1[M-H-CH₂]^-和213.063 7，推测化合物32为大黄素甲醚，来源于制何首乌。

4 讨论

为全面研究通脉养心丸中的化学成分，实验分别对提取溶剂、方式及时间进行了考察，结果表明，50%乙醇超声提取20 min为最佳提取条件。对流动相进行考察时，对比甲醇、乙腈，结果表明样品中的化合物在乙腈中的分离度更高。水相中加少量酸，可以改善各化合物的峰形并能增加其质谱响应，因此流动相最终确定为乙腈-水(0.1%甲酸)。通脉养心丸中化学成分种类较多，为全面鉴定其中的化合物，实验采用正、负离子两种质谱扫描模式对其进行定性分析。调节质谱裂解电压为135 V时，通脉养心丸中的化学成分可得到稳定的母离子峰，且产生相应成分的碎片离子，有利于对其进行定性分析。

实验采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术，通过对ESI正、负离子模式下的质谱信息及元素组成分析，并与部分标准品及参考文献中相应化合物的裂解碎片信息进行比对，共鉴定出通脉养心丸中32种化合物，包括12种黄酮类、5种有机酸类、4种木脂素类、3种皂苷类、2种蒽醌类、2种香豆素类、1种苯丙素类和3种其他类，基本明确了通脉养心丸的化学组成，有助于进一步对其药效成分进行深入探索，为通脉养心丸的质量控制、药效物质基础的阐明提供了科学依据。本实验中的UPLC-Q-TOF-MS/MS方法较普通液相法更为快速、准确，且充分体现了其在中药复方多成分鉴定中的优势，为中药复方物质基础研究提供了一种快速、有效的分析方法。