心力衰竭（简称心衰）是指由于各种原因导致的心肌结构和功能异常，引起心室收缩功能（射血）和/或舒张功能（充盈）受损的临床综合征。《中国心血管病报告2017》^[1]指出，心衰现患者人数高达450万，且患病率随年龄增加上升。随着中国逐渐步入老龄化社会，心衰防治工作将是中国医疗卫生事业的巨大挑战。

芪参颗粒以益气温阳、活血解毒立法，治疗心衰药效确切。前期研究表明：其清热解毒药味可通过改善能量代谢效率治疗心衰^[2]。金银花是芪参颗粒中清热解毒治法的代表性药物。獐牙菜苷，又名当药苷，是金银花中含量最高的环烯醚萜苷类化合物，有可能是芪参颗粒干预心衰的主要活性成分之一。既往獐牙菜苷的药理研究主要集中在治疗关节炎^[3]、骨质疏松^[4]、糖尿病^[5]等。治疗心血管疾病的相关报道较少，仅有一篇报道^[6]显示獐牙菜苷可以有效对抗乌头碱引发的大鼠心律失常，其作用机制与调节细胞自噬有关。

为进一步研究獐牙菜苷治疗心衰的药理活性，本研究采用BATMAN-TCM数据库对獐牙菜苷治疗心衰的作用及靶点进行预测，并采用异丙肾上腺素致心衰小鼠，观察其干预心衰的药效，分析起效环节，旨在发现獐牙菜苷干预治疗心衰的作用及其机制，进一步阐明芪参颗粒的效应成分及其机制，同时为治疗心衰提供新思路和新的候选药物。

1 材料 1.1 动物

SPF级C57/BL6N小鼠，体质量18~22 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物许可证号为SCXK（京）2016-0006。饲养于北京中医药大学SPF级动物实验室，恒温恒湿环境，自由饮水，普通饲料，适应性喂养一周后开始造模给药。

1.2 试剂

獐牙菜苷由成都普思生物科技有限公司提供（批号：PS0111123）。卡托普利由中美上海施贵宝制药有限公司（批号：AAQ3404）。盐酸异丙肾上腺素（ISO）由西格玛-奥德里奇（上海）贸易有限公司提供（批号：101722747）。钠钾ATP酶α1抗体由Abcam（上海）公司提供（货号：ab7671）。羊抗小鼠IgG-HRP标记抗体由北京拜尔迪生物技术有限公司提供（货号：DE0602）。RIPA裂解液由北京普利莱基因技术有限公司提供（货号：C1053）。

1.3 仪器

加拿大Vevo^®2100小动物超声影像平台，匈牙利3DHIESTECH数字切片扫描系统Pannoramic 250/MIDI，美国Bio-Rad凝胶成像系统Universal Hood Ⅱ，美国伯乐Bio-Rad小型垂直电泳转印系统。

1.4 BATMAN-TCM在线生物信息数据库

本数据库的网址http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/。

2 方法 2.1 分组与模型制备

C57/BL6小鼠常规饲养，适应性饲养一周后，随机分为空白组（8只）、模型组（11只）、卡托普利组（9只）、獐牙菜苷组（9只）。模型组与给药组采用课题组前期建立的梯度造模法^[7]：通过皮下注射过量ISO（第1日20 mg/kg，第2日10 mg/kg，第3~14日5 mg/kg）构建心衰小鼠模型。卡托普利组每天给予卡托普利16.5 mg/kg，獐牙菜苷组每天给予獐牙菜苷120 mg/kg^[8]，从造模第1天起给药，给药14 d。空白组每日给予等量蒸馏水。

2.2 心功能检测

实验终点，采用加拿大Vevo^®2100小动物超声影像平台评价小鼠心功能。测量左室收缩末内径（LVIDs）、左室舒张末内径（LVIDd），计算射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）。每只动物采样3次，记录3个连续心动周期的平均值用于后续分析。

2.3 病理学检测

取材时将心脏置于1%磷酸盐缓冲溶液（PBS）清洗血液，使用数码相机，拍摄、观察心脏整体形态。

心脏组织沿中心最大横径处切开，心底部浸入4%多聚甲醛固定24 h后，常规乙醇梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡包埋、切片贴片，进行苏木精-伊红染色（HE）。

2.4 数据库靶点预测

打开http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/，选择example 3，输入“Sweroside”，及该化合物的pubmed CID：161036，确定Score cutoff为20，以P < 0.05为统计学意义范围进行检索獐牙菜苷治疗心衰疾病靶点。

2.5 Western blot检测候选靶点

心肌组织液氮速冻，-80 ℃保存。RIPA裂解液提取心肌组织总蛋白。上样量为30 μg，电泳浓缩胶时电压为80 V，电泳分离胶时，电压为120 V，电泳1.5 h。电转采用恒流300 mA，1.5 h。5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4°孵育过夜（小鼠单克隆抗体，ATP1A1，1:5 000），TBS-T缓冲液漂洗3次，每次10 min；取出聚偏二氟乙烯膜（PVDF）加入二抗（羊抗小鼠IgG-HRP标记，1:5 000），室温孵育1 h，TBS-T缓冲液洗膜3次后，滴加ECL发光液，曝光。记录每条蛋白泳带的灰度值，采用Image lab进行定量分析。

2.6 统计学方法

采用SAS8.4统计软件进行数据分析，所有数据均以均数±标准差(x±s)表示，多组之间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法P < 0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果 3.1 小鼠心脏超声

模型组与空白组相比，EF、FS值显著降低（P < 0.01），LVIDs值显著增加（P < 0.01）、LVIDd有所增加（P < 0.05）；与模型组相比，獐牙菜苷可以显著改善过量ISO致心衰小鼠的EF和FS值（P < 0.01），使LVIDs显著降低（P < 0.01），对LVIDd无显著影响，该作用与阳性药卡托普利相近。见图 1。

3.2 病理学检测

剖检可见，与空白组小鼠相比，模型组小鼠心脏变大，给药组小鼠心脏与空白组小鼠心脏大小相近（见图 2）。心脏HE染色切片显微镜下观察可见，与空白组小鼠相比，模型组小鼠心脏组织左心室壁变薄，心肌纤维变细，部分动物心脏组织可见心肌纤维坏死、炎细胞浸润等病理改变；与空白组小鼠相比，卡托普利组和獐牙菜苷组小鼠心脏组织左心室壁厚度基本正常，心肌纤维无明显变细。见图 3。

3.3 BATMAN-TCM预测靶点

BATMAN-TCM数据库预测獐牙菜苷治疗心衰靶点为ATP1A1（ATPase Na⁺/K⁺ Transporting Subunit Alpha 1）。

3.4 Western blot结果

与空白组相比，模型组ATP1A1蛋白表达水平显著下调（P < 0.01）；与模型组相比，獐牙菜苷组ATP1A1表达上升（P < 0.01）。

4 讨论

心衰是多种心系疾病的重要转归，是各种心脏疾病的严重和终末阶段。目前西医多采用抑制神经内分泌激活的黄金三角治疗策略^[9]，尽管有一定的疗效，但不良反应较多，远未能满足临床需求。中医药中国的重要宝库，具有多水平、多层次、多途径、毒副作用小的起效特点。芪参颗粒治疗心衰疗效确切，机制研究涉及较广，但多采用复方整体研究思路^[10]，对效应成分的研究还不够。

为进一步揭示芪参颗粒发挥药效的主要成分，对芪参颗粒有效活性成分进行药效筛选。獐牙菜苷是芪参颗粒中特色药味金银花的有效成分，但目前关于其治疗心血管疾病的研究报道较少。故本研究依据BATMAN-TCM数据库对獐牙菜苷治疗心衰的作用靶点进行分类预测和筛选，预测靶点为，即Na⁺-K⁺-ATP酶α1亚基（ATP1A1）。三磷酸腺苷酶（NKA酶），是存在于细胞膜上的一种膜蛋白，由α、β、γ 3种亚基组成，α亚基是其中最重要的催化亚基，大小约为112 kDa，含有ATP、Na⁺、K⁺及强心苷的结合位点^[11]。α亚基的表达具有组织特异性和种属差异性，α1表达最为广泛，存在于所有细胞中，Na⁺-K⁺-ATP酶可利用ATP的水解产生能量，使3个Na⁺移出细胞，2个K⁺移入细胞，确保跨膜Na⁺、K⁺电化学梯度的产生和维持。

实验结果证明，皮下注射过量ISD可引起模型组小鼠发生心衰。獐牙菜苷可以显著改善过量ISD引起的心衰，且作用机制与预测靶点ATP1A1有关。心衰发生时，NKA酶α亚基的表达会发生改变，α1亚基具有离子泵与信号调节的功能^[12]。目前报道强心苷类药物的唯一作用靶点是NKA酶，但强心苷类药物具有药物治疗安全范围狭窄、容易中毒的缺点。獐牙菜苷可能通过ATP1A1发挥强心作用，一方面有助于揭示中药复方芪参颗粒起效的物质基础，另一方面这可能为具有强心作用的药物研究提供新的候选化合物。开发中医药宝库，挖掘更多活性成分，明确其靶标，有助于中医药事业的发展繁荣。

本研究通过过量ISO构建小鼠心衰模型，运用网络药理学方法预测靶点，并在蛋白表达水平进行验证，表明獐牙菜苷治疗心衰的药效与上调ATP1A1的表达量有关，为獐牙菜苷成为抗心衰药物的候选药物奠定了基础。但獐牙菜苷干预心衰的药效还需要通过其他动物模型进行验证。ATP1A1是否为獐牙菜苷的直接作用靶点，ATP1A1的表达量变化是否与獐牙菜苷的抗心衰药效存在因果关系，都还有待进一步的深入研究。