芍药-甘草是临床常用的药对之一，在许多古方及中成药制剂中都有应用，如芍药甘草汤、小建中汤、桂枝汤、真人养脏汤等。芍药-甘草配伍比例不同，功效主治也有差异，化学物质成分也可能存在差异。现代药理研究表明，芍药、甘草配伍，可协同增强抗炎镇痛和解痉功效^[1-2]。药对研究理论显示，药对配合在一起煎煮过程中伴随复杂的物理和化学反应，而在一系列变化发生的同时往往存在化学成分的转化或转换，药对配伍的化学成分也不是各单味中药化学成分的简单相加，其疗效和化学变化也不是各味中药的简单叠加，而往往是通过中药化学成分间发生复杂的协同、拮抗或转性等作用从而达到药物增效减毒等目的^[3-5]。本研究通过查阅《伤寒论》《金匮要略》《景岳全书》以及《太平惠民和剂局方》古方古籍，统计561方使用芍药-甘草药对，配伍比例从8:1~1:8。根据初步统计结果，选定16组配伍比例（1:0、10:1、10:2、10:3、10:4、10:5、10:6、10:7、10:8、1:1、1:2、1:3、1:4、1:6、1:8、0:1），通过测定不同比例芍药-甘草药对提取液的pH值、密度、出膏率和6种有效成分的含量综合探讨相关指标随芍药-甘草药对配伍变化规律，以期为深入探究含有芍药-甘草药对的传统经典名方汤剂和经典名方颗粒的质量控制体系质量标志物（Q-Marker）提供科学依据。

1 仪器与材料

仪器：岛津LC-20D型液相色谱仪（日本）、紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）、旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器）、电热恒温干燥箱（天津市天宇实验仪器有限公司）、煎药锅（深圳市正云科技有限公司）等。

药材：白芍饮片（产地安徽批号180801），甘草饮片（产地新疆批号180801）。

对照品：芍药苷（98%，批号23180-57-6，中国药品生物制品鉴定所），芍药内酯苷（98%，批号39011-90-0，Solarbio），氧化芍药苷（98%，批号1405-86-3，Solarbio），甘草酸（98%，批号1405-86-3，诗丹德），甘草苷（96.8%，批号551-15-5，诗丹德），异甘草苷（98%，批号5041-81-6，上海源叶生物科技有限公司）。

试剂：分析纯甲醇（天津市大茂化学试剂厂），色谱纯甲醇（≥99.9%，上海西格玛奥德里奇贸易有限公司），乙腈（≥99.9%，上海西格玛奥德里奇贸易有限公司），磷酸（85%，赛默飞世尔科技有限公司）。

2 方法与结果 2.1 不同比例芍药-甘草的供试品溶液制备

将白芍饮片和甘草饮片，分别按芍药-甘草1:0，10:1，10:2，10:3，10:4，10:5、10:6，10:7，10:8，1:1，1:2，1:3，1:4，1:6，1:8和0:1这16个比例组称取白芍饮片和甘草饮片共48 g。分别加入25倍量水，煎煮65 min，稠布过滤，各比例组滤液为（560±16）mL，各移取400 mL滤液浓缩至流动浸膏状（约80 mL），备用。

2.2 密度、pH值和出膏率的测定与结果 2.2.1 密度

密度系指在相同的温度、压力条件下，某物质的密度与水的密度之比。除另有规定外，温度为20 ℃。纯物质的相对密度在特定的条件下为不变的常数。因此选择合适量程的密度仪（1.0~1.1 mg/mL）分别测定16个滤液样品的密度。

2.2.2 pH值

应用pH测量计对16个样品进行测定，现将pH测量计进行校准，由于溶液显酸性，因此采用二点标定法，pH 6.86作为第一点，pH 4.00作为第二点，利用pH测量计分别测定16个提取液pH值。

2.2.3 出膏率

按照2015版《中华人民共和国药典》附录收载烘干法测定各比例组浸膏水分，计算出膏率。

2.2.4 密度、pH值、出膏率的结果

见表 1。

由图 1可知，芍药-甘草提取液的密度和pH与比例没有明显关系，密度变化范围为1.003±0.002，pH密度变化范围为4.94±0.11。

由图 2可知，芍药-甘草提取液在芍药-甘草配比为2:1时出膏率最低，芍药-甘草配比为1:2~1:8时，出膏率随甘草的增加而增加。

2.3 含量测定与结果 2.3.1 不同比例芍药-甘草的供试品溶液制备

分别精密称取不同比例组芍药-甘草浸膏0.100 0 g置于10 mL容量瓶，用60%甲醇-水溶解，定容，用0.45 μm微孔过滤，取续滤液用于高效液相色谱仪分析。

2.3.2 混合对照品溶液的制备

精密称取氧化芍药苷，芍药内酯苷，甘草苷，异甘草苷和甘草酸5种对照品适量，分别加甲醇制成1.012、1.018、1.012、1.012、1.014 mg/mL的对照品储备溶液，备用；精密称取芍药苷对照品粉末4.13 mg，将其移入5 mL容量瓶中加入甲醇混合均匀即得，分别制成含0.010 mg/mL氧化芍药苷，0.183 mg/mL芍药内酯苷，0.142 mg/mL甘草苷，0.010 mg/mL异甘草苷，0.316 mg/mL甘草酸，0.826 mg/mL芍药苷混合对照品溶液。

2.3.3 色谱条件

采用Kromasil 100-5-C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（B）-0.1%磷酸水溶液（A），梯度洗脱：0~8 min，14%~19% B；8~20 min，19%~28% B；20~25 min，28%~35% B；25~30 min，35%~45% B；30~40 min，45%~95% B；流速1.0 mL/min；检测波长为254 nm；柱温30 ℃。进样体积30 μL。

2.3.4 专属性实验

分别将单味药芍药和甘草供试样品溶液，按照“2.2.3”项下色谱条件分别进行分析，结果在与对照品色谱峰相应的位置无色谱峰，说明单味药芍药和甘草不影响测定（图 5）。

2.3.5 方法学考察 2.3.5.1 线性关系考察

分别精密量取上述混合对照品溶液5、10、15、20、30 μL注入高效液相色谱仪（HPLC），测定。以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表 2。

2.3.5.2 精密度实验

精密吸取供试品溶液（芍药:甘草为1:1）30 μL，按“2.4”项下色谱条件连续进样5次，精密度试验中1~6个标准品色谱峰面积RSD值分别为：1.4%，1.73%，2.97%，2.74%，2.68%和2.11%（n=6），结果表明，仪器精密度较好。

2.3.5.3 重复性实验

精密吸取供试品溶液30 μL（芍药:甘草为1:1），按“2.4”项下色谱条件连续进样6次，重复性试验中1~6个标准品色谱峰面积RSD值分别为：1.28%、1.59%、2.71%、2.78%、2.43%和1.86%，

2.3.5.4 稳定性实验

取供试品溶液，在室温下放置，分别于0、2、4、6、8、12 h进样30 μL分析，测定峰面积。稳定性试验1~6个标准品色谱峰面积RSD值分别为：2.52%、2.83%、2.64%、2.71%、1.81%和2.10%。

2.3.5.5 加样回收率实验

精密吸取已测得含量的芍药:甘草（1:1）提取液4 mL，平行精密吸取6份，分别加入等量混合对照品溶液，制成供试溶液，按照“2.2.3”项下色谱条件进样测定分析，得到氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、异甘草苷、甘草苷和甘草酸的平均回收率分别为99.32%、99.68%、99.85%、100.45%、100.75%和98.70%，RSD值分别为：2.85%、2.73%、1.84%、1.72%、1.65%和1.32%。

2.3.5.6 数据处理与结果

由图 3和4可知，氧化芍药苷、芍药内酯苷和芍药苷的溶出率呈无规律变化。芍药内酯苷和芍药苷的变化趋势相似，芍药内酯苷在比例组1:3时溶出率达到最大值，芍药苷在1:6比例时达到最大值。芍药内酯苷在10:4时达到最低值，而芍药苷在10:3时达到最低值。异甘草苷、甘草苷和甘草酸的溶出率呈无规律变化，甘草苷和甘草酸的变化趋势相近。在芍药-甘草比例为1:1时，异甘草苷、甘草苷和甘草酸溶出率均最低，在芍药-甘草比例为1:2和1:6时，异甘草苷、甘草苷和甘草酸溶出率均较高。

3 结论与讨论 3.1 芍药-甘草不同比例提取液常规参数的影响

芍药-甘草不同比例提取液的密度和pH与比例大小没有明显关系，密度变化范围为1.003±0.002，pH密度变化范围为4.94±0.11，提取液呈酸性。在含有芍药-甘草的经典名方或复方的质量控制指标成分选择时，注意方中碱性药味的影响。芍药-甘草不同比例煎煮过程中，出膏率整体变化趋势不大，变化范围为15.39±1.70，这为进行经典名方芍药甘草汤标准物质的常规参数研究提供依据。

3.2 芍药-甘草不同比例提取液化学成分的影响

芍药-甘草不同比例组煎煮过程化学成分的溶出率结果显示：芍药中主要活性成分氧化芍药苷、芍药内酯苷和芍药苷的溶出率呈无规律变化，芍药内酯苷和芍药苷的变化趋势较为接近，其中芍药-甘草比例为1:3时，芍药内酯苷溶出率最高，芍药-甘草比例为1:6时，芍药苷溶出率最高；甘草中主要活性成分异甘草苷、甘草苷和甘草酸的溶出率亦无明显规律，而甘草苷和甘草酸的变化趋势相近，其中芍药-甘草比例为10:3时，甘草苷溶出率最高，芍药:甘草为1:2时，甘草酸溶出率最高。芍药-甘草配比为1:3~1:8组，甘草明显促进芍药中的芍药内酯苷和芍药苷的溶出。鉴于以上结果，进行经典名方芍药甘草汤以及含有芍药-甘草药对的复方质量控制指标Q-Marker研究可考虑选择芍药药味中的芍药内酯苷和芍药苷，甘草药味中甘草苷和甘草酸。该结果与文献报道的芍药-甘草药对提取物的入血成分相一致^[6-7]。

3.3 芍药-甘草不同比例提取液煎煮方法的选择

芍药-甘草不同比例组煎煮方法与煎煮时间是参考张仲景《伤寒论》的芍药甘草汤（芍药-甘草比例为1:1）的制法进行16个比例组进行煎煮，并选择相同厂家相同型号的煎药锅，尽可能保证各比例组的制法一致，可避免产生操作误差。

3.4 芍药-甘草不同比例提取液色谱条件的选择

色谱条件筛选实验对比研究了乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.5%甲酸水溶液，甲醇-0.1%磷酸水溶液和乙腈-水等溶剂的分离结果，结果显示乙腈-0.1%磷酸水溶液，流速1 mL/min，柱温30 ℃条件下分离效果最好，色谱峰分布均匀，基线稳定。