小茴香为伞形科植物茴香（Foeniculum vulgare Mill.）的干燥成熟果实，始载于《唐本草》，味辛，温，具有散寒、理气和胃的功效^[1]。盐小茴香具有暖肾，散寒的功效，用于寒疝腹痛、睾丸偏坠、。现代药理研究证明，小茴香具有显著的抑菌、调节胃肠机能、利尿等作用，同时还具有利胆、保肝、促渗、抗癌、抗氧化抗突变及性激素样等作用^[2-5]。

中药“标准饮片”作为中药提取物和中成药生产中的原料，可以全面的表征中药饮片特征属性，进而完整控制饮片中药效物质，更专属、更准确地分别评价生、制饮片质量，保障中药饮片的安全性、有效性、质量可控^[6-7]。粉碎工艺的优化是标准饮片均匀化过程的重要环节，是后续一系列对于标准饮片内涵属性研究的基础。本实验以出粉率和紫丁香苷（SG）、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷（QG）的含量为指标，在此基础上设计L₉（3⁴）正交实验，采用“蛛网模式”^[8-9]优选生小茴香和盐小茴香标准饮片均匀化工艺，为制定生小茴香和盐小茴香标准饮片均匀化技术规范提供参考依据。

1 仪器与试药 1.1 仪器

ACQUITY^TM UPLC system超高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；XS 205型十万分之一电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司），AL 204型电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；DL 180E型智能超声波清洗器（上海之信仪器有限公司；功率：180W，频率：50 kHz）；TGL-16C型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；Milli-Q型超纯水系统（美国Millipore公司）；HYC-940医用冷藏箱（青岛海尔特种电器有限公司）；药筛：1~9号（上虞市冲压筛具厂）；FW80型粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。微量进样器（平头10 μL，上海高鸽工贸有限公司），硅胶G板（200 mm×100 mm，青岛海洋化工分厂）。

1.2 试剂

生小茴香购自河北春开制药股份有限公司，经天津中医药大学李天祥教授鉴定为伞形科植物茴香（Foeniculum Vulgaer Mill.）的干燥成熟果实。盐小茴香：严格按照2015版《中华人民共和国药典》盐炙法（通则0213）炮制。紫丁香苷（批号111574-201605）购自中国食品药品检定研究院，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷（批号R24S7F21842）购自上海源叶生物科技有限公司，HPLC分析纯度均≥95%。茴香醛（批号110838-201106）购自中国食品药品检定研究院。甲醇、甲酸均为色谱纯，水为超纯水。本文中小茴香是生小茴香和盐小茴香的统称；紫丁香苷简称为SG；槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷简称为QG。

2 方法 2.1 色谱条件

超高效液相色谱条件色谱柱ACQUITY UPLC^Ⓡ BEH C₁₈（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相：甲醇（B）- 0.1%甲酸水（A），梯度洗脱（0~7 min，95% → 63.5% A；7~12 min，63.5% → 15% A）；柱温40 ℃；流速0.3 mL/min；检测波长：254 nm；进样量：2 μL^[10]。

薄层色谱条件按照2015版《中华人民共和国药典》中薄层色谱法（通则0502）实验，吸取样品和对照品溶液各1~5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60~90℃）-乙酸乙酯（17:2.5）为展开剂，展至8 cm，取出，晾干，喷以二硝基苯肼试液，日光下检视。

2.2 对照品溶液制备

分别取SG、QG对照品适量，精密称定，制成质量浓度为1 mg/mL的对照品储备液，备用。分别取上述SG、QG对照品储备液500 μL、700 μL，置于5 mL容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为99.30 mg/mL、123.8 mg/mL的混合对照品溶液，供定量分析用。

取茴香醛对照品，加乙醇制成每1 mL含1 μL的溶液，作为对照溶液，供薄层鉴别用。

2.3 供试品溶液的制备

取小茴香粉末0.5 g，精密称定，置于25 mL的容量瓶中，加适量50%甲醇，密塞，超声处理（功率144 W，频率50 kHz）20 min，放冷，50%甲醇定容至刻度，摇匀，14 000 r/min离心10 min，取上清液，过滤，取续滤液1 mL，加1 mL蒸馏水，混匀，供定量分析用。

取小茴香粉末2 g，加乙醚20 mL，超声处理（功率144 W，频率50 kHz）10 min，滤过，滤液挥干，残渣加三氯甲烷1 mL使溶解，供薄层鉴别用。

2.4 不同目数的小茴香饮片粉末分布及对指标成分的影响研究

取生小茴香和盐小茴香各100 g，粉碎机单次粉碎10 s，采用《中华人民共和国药典》规定的标准药筛制备不同粒度的粉末，称取不同药筛上未通过该药筛的样品粉末重量，分别计算其比例。按“2.3”项下方法处理样品A ~ H（生小茴香饮片粉末）和样品A' ~ H'（盐小茴香饮片粉末）制备含量测定和薄层鉴别样品，按“2.1”色谱条件测定供试品溶液中SG、QG的含量，薄层色谱条件鉴别不同粒度小茴香饮片粉末。

2.5 基于“蛛网模式”的小茴香饮片粉碎工艺正交实验研究

以粉碎时间、粉碎次数、投料量（以投料药材占粉碎室的体积计）为因素，以出粉率、化合物含量为指标进行正交实验，借鉴本课题组研究的“蛛网模式”^[11]原理，优选最佳粉碎工艺。Ga、G'a分别代表生小茴香和盐小茴香中出粉率，SG和QG的总量为Za和Z'a，其中a为不同粉碎方式（9个正交实验组，a为1~9）的小茴香饮片粉末样品。

为了消除不同指标取值范围差异对统计结果的影响，需对不同变量指标进行归一化处理。生小茴香和盐小茴香样品中最大出粉率为Ga（max）和G'a（max）；SG和QG的最高总含量为Za（max）和Z'a（max）。将所得指标的数值分别除以其最大值，得到出粉率的归一化结果分别为Qa和Q'a，SG、QG总量的归一化结果分别为Ha和H'a。计算公式1、2如下所示。

(1)

(2)

通过计算Qa和Ha（Q'a和H'a）组成的阴影部分面积，优选生小茴香和盐小茴香饮片的最佳粉碎方式，其归一化面积分别为S和S'，计算公式3、4如下所示。

(3)

(4)

2.6 小茴香饮片最佳粉碎工艺研究验证

取生小茴香和盐小茴香，以确定的小茴香最佳粉碎工艺制备小茴香标准饮片粉末，计算出粉率；按“2.3”项下方法制备小茴香饮片粉末供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定供试品溶液中SG、QG的含量。

3 结果与讨论 3.1 不同目数的小茴香饮片粉末分布及对指标成分的影响研究

由图 1所示，小茴香饮片粉末全部通过10目筛，生品中56.29%粉末通过24目筛，盐品粉末中75.99%通过24目筛；生品粉末中33.49%通过50目筛，盐品粉末中43.17%通过50目筛；生品盐品中均未有粉末通过200目筛。由结果可以看出经过高温炮制之后的小茴香饮片，质地更为疏松，更利于粉碎。SG和QG指标含量随标准筛目数增加，含量增加。薄层色谱结果显示生品盐品中茴香醛的含量随标准筛目数增加，斑点颜色加深。盐品中茴香醛斑点强度弱于生品中茴香醛强度，结果见图 2。

3.2 基于“蛛网模式”的小茴香饮片粉碎工艺正交实验研究

结合小茴香饮片粉末目数分布的结果和2015版《中华人民共和国药典》小茴香项下的相关规定，采用中国药典规定的标准药筛三号筛制备小茴香标准饮片粉末，按“2.3”项下方法制备小茴香饮片粉末供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定供试品溶液中指标成分的含量。以粉碎时间、粉碎次数、投料量（以投料药材占粉碎室的体积计）为因素，以出粉率、化合物含量为指标进行正交实验，优选最佳粉碎工艺，测定结果见表 1。

按“2.5”项下计算公式对小茴香粉末出粉率、化合物含量进行归一化处理，计算其归一化面积，结果见图 3。通过正交实验设计助手对实验数据进行分析，以归一化面积（S）为指标进行评价，考察因素对生小茴香饮片研究结果的归一化面积的影响为：粉碎次数 > 粉碎时间 > 投料量，最佳粉碎工艺为A3B3C3，即投料量为1/2粉碎室的体积，单次粉碎时间40 s，粉碎3次，过50目筛，即得。考察因素对盐小茴香饮片研究结果的归一化面积的影响为：粉碎次数 > 投料量 > 粉碎时间，最佳粉碎工艺为A3B2C3，即投料量为1/2粉碎室的体积，单次粉碎时间40 s，粉碎2次，过50目筛，即得。

3.3 生小茴香和盐小茴香饮片最佳粉碎工艺验证研究

采用“2.6”项下方法，采用最佳粉碎工艺制备小茴香标准饮片粉末，计算出粉率及SG、QG的含量，结果见表 2。

综上可知，采用最佳粉碎工艺制备的生小茴香饮片的出粉率84.93%，RSD为1.44%（n=3）；SG、QG的总含量为3.473 mg/g，RSD为1.01%（n=3），说明生小茴香最佳粉碎工艺稳定、可行。采用最佳粉碎工艺制备的盐小茴香饮片的出粉率92.01%，RSD为0.57%（n=3）；SG、QG的总含量为1.740 mg/g，RSD为1.50%（n=3），说明盐小茴香最佳粉碎工艺稳定、可行。

4 结论

实验利用“蛛网模式”的研究方法，通过出粉率、指标成分的总含量计算归一化面积（S），采用正交实验法以S为指标对小茴香进行粉末均匀化工艺研究。经粉碎工艺放大验证，该方法可行，为小茴香的标准饮片均匀化技术规范制定提供参考依据。