重黄温敏凝胶中重楼皂苷Ⅵ含量测定及体外释放研究

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孙媛, 丁江生, 万近福

SUN Yuan, DING Jiangsheng, WAN Jinfu

Determination and release in vitro of polyphyllin VI in ChongHuang thermosensitive in situ gel

天津中医药大学学报, 2020, 39(2): 226-230

Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2020, 39(2): 226-230

http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2020.02.23

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收稿日期: 2019-12-20

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孙媛, 丁江生, 万近福. 重黄温敏凝胶中重楼皂苷Ⅵ含量测定及体外释放研究[J]. 天津中医药大学学报, 2020, 39(2): 226-230.

SUN Yuan, DING Jiangsheng, WAN Jinfu. Determination and release in vitro of polyphyllin VI in ChongHuang thermosensitive in situ gel[J]. Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2020, 39(2): 226-230.

重黄温敏凝胶中重楼皂苷Ⅵ含量测定及体外释放研究

孙媛^1,2,3 , 丁江生^1,2,3 , 万近福^1,2,3

1. 云南省药物研究所, 昆明 650111;
2. 云南白药集团创新研发中心, 昆明 650111;
3. 云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室, 昆明 650111

收稿日期: 2019-12-20

基金项目: 云南省科技厅项目（2018DC002）

作者简介: 孙媛(1982-), 女, 高级工程师, 主要从事新药制剂研究.

摘要: [目的] 建立重黄温敏凝胶中重楼皂苷VI的含量测定方法，并进行体外释放研究。[方法] 采用HPLC-ELSD法，色谱柱为CAPCELL PAK C₈柱（4.6 mm×250 mm，5μm），乙腈（A）-水（B）为流动相，梯度洗脱（0~15 min，25%~35% A；15~35 min，35%~40% A；35~40 min，40%~60% A），柱温25℃，流速1.0 mL/min，进样量10 μL，漂移管温度92℃，载气流速2.9 L/min。以体外溶蚀法，对重黄温敏凝胶的累积释放情况，进行考察。[结果] 重楼皂苷VI在0.430 0~4.300 0 mg范围内线性良好，lgA=1.796 9lgC +4.398 9（r²=0.999 9），定量限为0.054 0 mg，平均回收率为101.70%（RSD=1.17%，n=9），体外释放符合Higuchi方程。[结论] 该方法方便、稳定、高效，可用于重黄温敏凝胶体外释放研究。

关键词: 重黄温敏凝胶重楼皂苷VI 体外释放高效液相色谱-蒸发光散射检测

Determination and release in vitro of polyphyllin VI in ChongHuang thermosensitive in situ gel

SUN Yuan^1,2,3 , DING Jiangsheng^1,2,3 , WAN Jinfu^1,2,3

1. Yunnan Institute of Materia Medica, Kunming 650111, China;
2. Yunnan Baiyao Group Innovation and R&D Center, Kunming 650111, China;
3. Yunnan Province Company Key Laboratory for Traditional Chinese Medicine and Ethnic Drug of New Drug Creation, Kunming 650111, China

Abstract: [Objective] To establish a determination method for the content of polyphyllin VI in ChongHuang thermosensitive in situ gel and to study the release in vitro. [Methods] A HPLC-ELSD method was adopeted with the CAPCELL PAK C₈ column (4.6 mm×250 mm, 5 μm), with the mobile phaseconsisting of acetonitrile(A)-water(B)at the flow rate of 1.0 mL/min (0~15 min, 25%~35% A; 15~35 min, 35%~40%A; 35~40 min, 40%~60%A), with the column temperature 25℃, with the injection volume 10 μL, with the drift tube temperature 92℃ and the carrier gas pressure was 2.9 L/min. [Results] The polyphyllin VI has good linearity in the range of 0.430 0~4.300 0 mg, lgA=1.796 9lgC+4.398 9(R²=0.999 9), The average recovery rate was 101.70% (RSD=1.17%, n=9). The in vitro release study indicated that drug release of polyphyllin VI was best fitted to Higuchi equation. [Conclusion] The established method is proved to be convenient, stable and efficient.

Key words: Chonghuang thermosensitive in situ gel polyphyllin VI in vitro release HPLC-ELSD

重楼为百合科植物云南重楼Paris polyphylla Smith var. yunnanensis(Franch.) Hand.-M.azz.或七叶一枝花Paris polyphylla Smith var. chinensis(Franch.) Hara的干燥根茎, 性凉, 味苦, 微寒, 有小毒, 归肝经。具有清热解毒、消炎消肿、凉肝熄风、利胆退黄、除风定痉、止血止痛、攻坚化积、截疟等功效。可补水、气、血, 通气血。现代药理研究表明, 重楼具有抗肿瘤、止血止痛、抗病毒, 抑菌消炎和免疫调节及肝脏保护等作用。现已分离并鉴定出50余种化合物, 主要为皂苷类成分, 约占化合物总含量的80%。重楼皂苷具有抗肿瘤、清热解毒、消炎止痛、止血等功效，是宫血宁等中成药的主要成分之一^[1-6]。

重楼皂苷主要活性成分是甾体皂苷及苷元, 其中又分为薯蓣皂苷类化合物和偏诺皂苷类化合物。《中华人民共和国药典》规定了薯蓣皂苷类化合物重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ和偏诺皂苷类化合物重楼皂苷Ⅵ、Ⅶ作为衡量重楼植物药用价值的指标。近年来的研究进一步表明偏诺类皂苷在药理活性上更具优势, 特别是其中的重楼皂苷Ⅵ有止血、祛痰、抑菌、镇静镇痛、抗早孕杀灭精子、抗肿细胞等作用, 临床用于治疗功能性子宫出血等。因此, 采用主要含偏诺类皂苷的重楼提取物进行组方, 制备重黄温敏凝胶。同时, 鉴于偏诺皂苷类化合物的4个主要指标成分中重楼皂苷Ⅵ含量最低, 也最易被干扰出现检测误差而影响重黄温敏凝胶的质量判断。因此, 本实验选择重楼皂苷Ⅵ作为检测指标, 采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)对重黄温敏凝胶的质量情况和体外溶蚀释放情况进行考察, 为该药制剂成型和体内释药研究提供理论依据^[7-10]。

1 材料 1.1 仪器

Agilent1100高效液相色谱仪(美国安捷伦); 2000ES ELSD检测器(美国奥泰公司); XWK-Ⅲ型空气发生器(天津市津分分析仪器制造有限公司); ZRS-8G智能溶出实验仪(天津大学无线电厂); THZ-82恒温振荡器(金坛市富华仪器有限公司); ETS——4fuzzy磁力搅拌器(德国IKA); AR2130型电子天平(美国Capintec公司); Delta320 PH计(梅特勒托利多); KH3200E黏度测定仪(昆山禾创超声有限公司); KH3200E超声波清洗仪(昆山禾创超声有限公司); DZKW-S-6电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗)。

1.2 试剂和药品

重楼皂苷Ⅵ对照品(中国食品药品检定研究院, 批号111592-201203);重黄温敏凝胶(自制); 泊洛沙姆407(Poloxamer 407, 德国BASF公司); 泊洛沙姆188(Poloxamer 188, 德国BASF公司); 丙二醇(国药试剂集团); 乙腈(色谱纯, 默克股份); 超纯水; 其他试剂为分析醇。

2 方法与结果 2.1 重黄温敏凝胶的制备

精密称取处方量的重楼等提取物, 加入丙二醇分散, 再在连续搅拌下依次加入水、苯扎溴铵和泊洛沙姆407、泊洛沙姆188, 搅拌直至完全溶解, 加水定重, 放置4℃冷藏24 h, 即得。

2.2 含量测定 2.2.1 色谱条件

CAPCELL PAK C₈色谱柱(5 μm, 4.6 mm×250 mm, 资生堂), 乙腈(A)-水(B)为流动相, 梯度洗脱(0~15 min, 25%~35% A; 15~35 min, 35%~40% A; 35~40 min, 40%~60% A), 柱温25℃, 流速1.0 mL/min, 进样量10 μL, 漂移管温度92℃, 载气流速2.9 L/min, 增益2, 撞击器关。

2.2.2 对照品溶液制备

精密称取重楼皂苷Ⅵ对照品21.5 mg, 置50 mL容量瓶中, 加甲醇溶解并定容至刻度, 超声(150 W, 40 kHz)5 min, 摇匀, 即得。

2.2.3 样品溶液制备

精密称取2.0 g重黄温敏凝胶, 置于10 mL容量瓶中, 加甲醇8mL, 超声20 min, 放冷, 甲醇定容至刻度, 0.45 μm微孔滤膜过滤, 即得。

2.2.4 专属性实验

分别将重楼皂苷Ⅵ对照品溶液、样品溶液、空白溶液以及样品加对照品溶液按上述色谱条件进行测定, 记录色谱图。此条件下重楼皂苷Ⅵ分离良好, 无干扰。见图 1。

A：对照品溶液B：样品溶液C：对照及样品混合溶液D：空白溶液图 1 专属性实验HPLC图

图选项

2.2.5 线性关系和定量限考察

分别精密量取2.2.2项下重楼皂苷Ⅵ对照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL置于10 mL容量瓶中, 加甲醇定容, 摇匀, 0.45 μm滤膜过滤, 按2.2.1项下色谱条件测定, 记录峰面积。以峰面积的常数对数值(lgA)对浓度的常数对数值(lgC)进行线性回归, 得回归方程为:lgA=1.796 9 lgC+4.398 9(r²=0.999 9), 0.430 0~4.300 0 mg范围内, 线性关系良好。以信噪比(S/N)约为10的重楼皂苷Ⅵ对照品溶液为定量限:0.054 0 mg。

2.2.6 精密度实验

精密量取2.2.5项下对照品溶液, 按上述色谱条件连续进样6次, 记录峰面积, 计算重楼皂苷Ⅵ的峰面积的RSD为1.51%(n=6), 表明精密度良好。

2.2.7 稳定性实验

取同一份样品溶液, 分别于0、2、4、8、12、24 h按上述色谱条件测定, 记录峰面积, 计算重楼皂苷Ⅵ的峰面积的RSD为3.08%(n=6), 表明样品溶液在24 h内稳定。

2.2.8 重复性实验

精密称取2.0 g重黄温敏凝胶6份, 按2.2.3项下要求, 配制样品溶液, 按上述色谱条件测定, 记录峰面积, 计算重楼皂苷Ⅵ的含量, RSD为2.70%(n=6), 表明重复性良好。

2.2.9 回收率实验

精密称取已知含量的重黄温敏凝胶, 分别按含量的50%、100%、150%精密加入重楼皂苷Ⅵ对照品, 按2.2.3项制备样品溶液, 每个浓度平行制备3份, 按上述色谱条件测定, 记录峰面积, 计算回收率。见表 1。

表 1 加样回收率实验结果表（n=9）

表选项

2.2.10 含量测定

分别精密称取3批重黄温敏凝胶, 按2.2.3项制备样品溶液, 每个样品平行制备2份, 按上述色谱条件测定, 记录峰面积, 计算含量, 为标示量的90%~110%。见表 2。

表 2 重楼皂苷VI含量测定结果表

表选项

2.3 胶凝时间测定

采用试管倒置法来判断凝胶的相变温度:平行称取6份重黄温敏凝胶于试管中, 将试管置于水浴中缓慢升温, 于分别于(31.0±0.1)℃、(32.0±0.1)℃、(35.0±0.1)℃、(37.0±0.1)℃、(39.0±0.1)℃、(41.0±0.1)℃、(43.0±0.1)℃和(45.0±0.1)℃测定胶凝时间, 每间隔30 s倾斜一次试管, 直至凝固, 记录时间。见图 2。

图 2 胶凝曲线图（n=6）

图选项

证明此温敏凝胶从(35.0±0.1)℃起, 胶凝时间明显加快, 在体温时(37±0.1)℃仅需(2.90±0.58) min即可成胶。

2.4 体外释放考察

取25 mL具塞试管, 精密称取5.0 g重黄温敏凝胶于试管内, 置于(37±0.1)℃恒温水浴振荡器中, 待完全凝胶后, 缓缓加入已脱气的pH4.0的磷酸盐缓冲液5.0 mL, 平行制备6份样品, 放入(37.0±0.1)℃恒温水浴振荡器中, 振荡频率为120 r/min, 于0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、30、36、48 h取样, 取出全部溶蚀介质, 称重后将试管放回恒温水浴振荡器中胶凝, 缓慢补加相同温度的空白溶蚀介质5.0 mL, 重复操作, 直至剩余凝胶质量不足初始重量的10%。相邻时间点间质量差异即为重黄温敏凝胶溶蚀量。每个时间点取样后, 按相应比例加入甲醇稀释至规定体积, 0.45 μm微孔滤膜过滤, 采用上述色谱条件进行检测, 记录峰面积, 计算重楼皂苷Ⅵ的累积释放量。并对各时间点的药物累积释放率进行探讨。见表 3和图 3。

图 3 重黄温敏凝胶pH4.0缓冲液中溶蚀释放情况

图选项

表 3 重黄温敏凝胶溶蚀释放拟合表

表选项

结果显示, 重黄温敏凝胶溶蚀量和重楼皂苷Ⅵ体外释放均符合Higuchi方程, 12 h释放67.63%, 24 h释放85.65%。表明重黄温敏凝胶在人体阴道微环境中释药, 基质溶蚀是限速条件。

3 讨论

2015版《中华人民共和国药典》重楼项下的紫外检测波长为203 nm, 重黄温敏凝胶在该波长下测定时重楼皂苷Ⅵ干扰明显, 无法达到预期检测效果。本研究采用HPLC-ELSD检测, 不仅药典项下的4种重楼皂苷实现良好的分离检测, 还将偏诺重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷PA和重楼皂苷H进行了较好的分离, 为进一步研究重楼偏诺皂苷提供了技术支持。

重黄温敏凝胶的体外溶蚀释放符合Higuchi方程, 且在12 h释放可达67.63%, 不仅满足用药需求, 还能减少药物给药次数, 保证药效的同时, 增加患者的用药顺应性, 为重黄温敏凝胶制剂推广提供依据。

本实验主要对药物从重黄温敏凝胶制剂中释放的情况进行了研究, 对于释放后在人体阴道中的吸收利用情况还需进一步探讨。

重黄温敏凝胶需在体内以半固体形态存在, 且随着处方中黏性物质比例的增加, 凝胶强度进一步加大, 药物释放较低温时的液体形态发生明显改变。因此, 体外溶蚀释放研究对药物的利用和疗效有指导意义。

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