天津中医药大学学报  2020, Vol. 39 Issue (3): 316-319

文章信息

高常柏, 胡文仲, 姜楠, 王宝娟, 杨美娟, 许云
GAO Changbai, HU Wenzhong, JIANG Nan, WANG Baojuan, YANG Meijuan, XU Yun
真武汤合苓桂术甘汤改善心肾综合征大鼠模型水钠潴留的作用机制研究
Mechanism of Zhenwu Decoction and Linggui Zhugan Decoction in improving water-sodium retention in rat model of cardiorenal syndrome
天津中医药大学学报, 2020, 39(3): 316-319
Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2020, 39(3): 316-319
http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2020.03.15

文章历史

收稿日期: 2020-01-25
 Abstract              PDF               Figures               Tables
引用本文 0
高常柏, 胡文仲, 姜楠, 王宝娟, 杨美娟, 许云. 真武汤合苓桂术甘汤改善心肾综合征大鼠模型水钠潴留的作用机制研究[J]. 天津中医药大学学报, 2020, 39(3): 316-319.
GAO Changbai, HU Wenzhong, JIANG Nan, WANG Baojuan, YANG Meijuan, XU Yun. Mechanism of Zhenwu Decoction and Linggui Zhugan Decoction in improving water-sodium retention in rat model of cardiorenal syndrome[J]. Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2020, 39(3): 316-319.
真武汤合苓桂术甘汤改善心肾综合征大鼠模型水钠潴留的作用机制研究
高常柏 , 胡文仲 , 姜楠 , 王宝娟 , 杨美娟 , 许云     
天津中医药大学第二附属医院, 天津 300250
收稿日期: 2020-01-25
基金项目: 天津市卫生计生委中医中西医结合课题（A01-2017136）
作者简介: 高常柏(1964-), 男, 硕士, 副主任医师, 从事肾病风湿科临床诊疗工作.
摘要: [目的] 研究真武汤合苓桂术甘汤对心肾综合征大鼠模型水钠潴留的作用机制。[方法] 将60只雄性SD大鼠随机分为两组，即空白组与手术组，空白组大鼠常规饲养，手术组大鼠经5/6肾切除联合异丙肾上腺素皮下注射制备心肾综合征模型，剔除死亡大鼠后，将手术组剩余成模大鼠按体质量分层随机分为空白组、中药组、常规治疗组。中药组给予真武汤合苓桂术甘汤灌胃，给药量为7.29 g生药/（kg·d）；常规治疗组给予贝那普利（0.45 mg/kg）+呋塞米（1.8m g/kg）；空白组予以等容积生理盐水灌胃，每日1次，连续6周。观察实验过程中各组大鼠的精神状态、活动情况、灵敏度、毛发情况、食欲、大小便等一般情况及死亡情况，比较各组灌胃前、灌胃6周后的血清脑钠肽（BNP）、血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、尿水通道蛋白2（AQP2）的前后差值情况。[结果] 灌胃6周后，中药组大鼠一般情况较灌胃前改善、喘息不明显，常规治疗组一般情况同样较灌胃前改善。通过比较治疗前后各组大鼠实验室指标差值发现，中药组与常规治疗组BNP均下降，中药改善大鼠心力衰竭情况接近常规治疗组水平，两组下降水平无统计学差异（P>0.05）；中药组Scr水平较前下降，常规治疗组Scr水平升高；中药组尿AQP2水平较前略增高，与空白组尿AQP2水平无统计学差异（P>0.05），常规治疗组尿AQP2水平较前明显升高。[结论] 心肾综合征大鼠尿AQP2的表达主要由肾脏调控，AQP2可作为心肾综合征水钠潴留状态的参考指标，真武汤合苓桂术甘汤改善心肾综合征大鼠水钠潴留状态的作用机制可能是通过抑制大鼠肾脏AQP2过度表达，减少水的重吸收，改善了水钠潴留状态。
关键词: 真武汤合苓桂术甘汤    心肾综合征    大鼠    水通道蛋白2    异丙肾上腺素    5/6肾切除    
Mechanism of Zhenwu Decoction and Linggui Zhugan Decoction in improving water-sodium retention in rat model of cardiorenal syndrome
GAO Changbai , HU Wenzhong , JIANG Nan , WANG Baojuan , YANG Meijuan , XU Yun     
Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300250, China
Abstract: [Objective] To study the mechanism of Zhenwu Decoction and Linggui Zhugan Decoction on water and sodium retention in rats with cardiorenal syndrome. [Methods] The 60 SD rats were randomly divided into two groups, the blank group and the operation group. Cardiorenal syndrome model was established by 5/6 nephrectomy combined with subcutaneous injection of isoproterenol in rats of operation group. After eliminating the dead rats, the remaining rats in the operation group were randomly divided into model group, traditional Chinese medicine group (TCM group) and conventional treatment group according to body weight. Rats in the TCM group were received 7.29 g crude drug/(kg·d)for intragastric administration. The routine treatment group was given benazepril[0.45 mg/(kg·d)] and furosemide[1.8 mg/(kg·d)]. The blank group and model group were intragastrically administered with normal saline of equal volume. They were given once a day for 6 consecutive weeks. The mental state, activity, sensitivity, hair condition, appetite, urine and feces and mortality of rats in each group were observed during the experiment. The difference of serum brain natriuretic peptide (BNP), serum creatinine (Scr), serum urea nitrogen (BUN) and urinary aquaporin 2 (AQP2) before and 6 weeks after gastric administration were compared. [Results] After 6 weeks of intragastric administration, the general situation of rats in the TCM group was better than that before gastric administration, and the wheezing was not obvious. The general situation of rats in the conventional treatment group was also better than that before gastric administration. By comparing the difference of laboratory indexes of rats before and after treatment, it was found that BNP in the TCM group and the conventional treatment group decreased, and the improvement of heart failure in the TCM group was close to the level of the conventional treatment group. There was no significant difference between the two groups (P>0.05). The level of Scr in TCM group was lower than before, while that in the conventional treatment group was higher. The level of AQP2 in urine of TCM group was slightly higher than before. There was no significant difference in urinary AQP2 level between TCM group and blank group (P>0.05). The level of urinary AQP2 in routine treatment group was significantly higher than that before. [Conclusion] The expression of urinary AQP2 in rats with Cardiorenal Syndrome is mainly regulated by the kidney, AQP2 can be used as a reference index for water and sodium retention in patients with cardiorenal syndrome. Zhenwu Decoction and Linggui Zhugan Decoction can improve the state of water and sodium retention in rats with cardiorenal syndrome. It may be through inhibiting the excessive expression of AQP2 in the kidney of rats, reducing the reabsorption of water and improving the state of water and sodium retention.
Key words: Zhenwu Decoction and Linggui Zhugan Decoction    cardiorenal syndrome    rats    aquaporin 2    isoproterenol    5/6 renectomy    

心肾综合征是一组心肾共同受损的临床综合征, 即心、肾中某一脏器的功能不全可直接或间接导致另一脏器的损伤, 或两者共同受损[1]。水钠潴留是心肾综合征的标志, 亦是加重心肾综合征的关键因素, 因此消除水钠潴留是缓解心肾综合征的重要手段, 利尿剂+血管紧张素转换酶抑制剂/血管紧张素受体拮抗剂(ACEI/ARB)是目前临床治疗的常规用药[2], 然而已有研究报道利尿剂抵抗可加重肾功能损害以及心力衰竭的再入院风险, 增加患者病死率[3]。肾脏是水钠代谢的重要器官, 有研究发现[4]水通道蛋白2(AQP2)在水钠潴留时其表达水平升高, 可在一定程度上反映机体水钠潴留状态。心肾综合征肾脏AQP2的过度表达, 亦是其水钠潴留发生的重要机制之一, 若抑制了AQP2的表达, 便能减少肾脏对水的重吸收, 从而减轻水肿, 延缓病情进展。

水钠潴留与中医"水肿"类似, 早在《黄帝内经》中即有"水、风水、水胀、水病"的记载, 中医对水肿的治疗方法颇多。近年研究发现, 真武汤和苓桂术甘汤均在缓解水肿、保护心肾功能方面有独特优势[5], 本实验旨在探究真武汤合苓桂术甘汤改善心肾综合征水钠潴留的作用机制以及对尿AQP2表达的影响, 为临床中医治疗心肾综合征提供实验理论依据。

1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 动物

清洁级SD雄性大鼠60只, 体质量140~160 g, 由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.1.2 主要药物

真武汤合苓桂术甘汤药物组成:白术30 g, 茯苓15 g, 桂枝10 g, 甘草6 g, 附子(先煎)10 g, 芍药10 g, 生姜3片, 由天津中医药大学第二附属医院药房提供, 使用时配制成每毫升含1.2 g生药的水溶液, 置于4℃冰箱保存, 每次配制完成仅使用1周, 弃去剩余药液并重新配置; 呋塞米片(20 mg)、贝那普利片(5 mg)、异丙肾上腺素(SIGMA)、戊巴比妥钠、注射用青霉素钠[山西省芮城县红宝兽药有限责任公司, 兽药字(2014)040102659]、75%乙醇、0.9%氯化钠注射液、注射用水、碘伏等。

1.1.3 主要试剂

大鼠尿素氮(BUN)酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒、大鼠脑钠肽(BNP) ELISA检测试剂盒、大鼠血肌酐(Scr) ELISA检测试剂盒、大鼠AQP2 ELISA检测试剂盒, 均购自武汉纯度生物科技有限公司。

1.2 实验方法 1.2.1 分组及造模方法

根据课题组自制心肾综合征大鼠造模方法[6], 将60只雄性SD大鼠随机分为两组, 正常组10只, 手术组50只, 正常组大鼠常规饲养, 手术组大鼠在2%戊巴比妥钠35 mg/kg腹腔注射麻醉下, 先将左肾2/3切除, 1周后再将右肾全切, 剔除死亡大鼠。剩余大鼠1周后皮下注射异丙肾上腺素, 连续2 d (间隔24 h, 注射量分别为2.5、1.5 mg/kg), 注射后常规饲养1周, 剔除死亡大鼠。将剩余存活大鼠按体质量分层随机分为空白组、中药组、常规治疗组。

1.2.2 给药方法

造模完成后1周开始灌胃给药, 大鼠具体用药剂量参照《药理实验方法学》[7]中"人与动物间按体表面积折算的等效剂量比值表"计算, 按照人与大鼠体质量70 kg:200 g的系数为0.018, 中药按照患者每日服用81 g生药计算, 中药组大鼠给药量为7.29 g生药(/kg·d), 常规治疗组给予贝那普利(0.45 mg/kg)+呋塞米(1.8 mg/kg), 空白组予等容积的生理盐水灌胃, 3组大鼠灌胃均为每日1次, 连续6周。

1.3 观察指标 1.3.1 一般情况

观察实验过程中各组大鼠的精神状态、活动情况、灵敏度、毛发情况、食欲、大小便等一般情况及死亡情况。

1.3.2 实验室指标检测

大鼠分别在灌胃前、灌胃6周后使用代谢笼留尿1.5 mL, 并在当天取大鼠眼底静脉丛血1.0~1.5 mL, 3 500 r/min离心10 min, 离心半径60mm, 分离血清, 检测血Scr、BUN以及尿AQP2。全部检测由武汉纯度生物科技有限公司完成。

1.4 统计学方法

采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析, 符合正态分布的计量资料使用均数±标准差(x±s)表示, 两组间比较采用独立样本t检验, 所有统计检验均采用双侧检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 一般情况

灌胃6周后, 空白组、中药组、常规治疗组大鼠死亡例数依次为1、2、4只。大鼠死亡前均可观察到其不喜活动、蜷缩喘息、体质量骤降等表现。灌胃6周后, 中药组与常规治疗组大鼠一般情况均较灌胃前改善、喘息不明显。

2.2 大鼠体质量的比较

大鼠造模后, 体质量增长较空白组明显缓慢, 两组与空白组比较均有统计学差异(P < 0.05或P < 0.01), 常规治疗组与中药组大鼠体质量之间无统计学差异(P>0.05)。见表 1。

表 1 大鼠体质量的比较（x±s）
表选项
2.3 各组大鼠灌胃前后观测指标差值图

空白组、中药组及常规治疗组BNP较造模前降低, 组间比较无统计学差异(P>0.05);空白组、中药组及常规治疗组BUN较造模前升高, 组间比较无统计学差异(P> 0.05);空白组、中药组Scr较造模前降低, 常规治疗组较造模前升高, 组间比较无统计学差异(P>0.05);空白组、中药组及常规治疗组AQP2较造模前升高, 组间比较无统计学差异(P>0.05)。见表 2。

表 2 各组大鼠灌胃前后观测指标差值表（x±s）
表选项
3 讨论

水通道蛋白是水分子通过细胞膜的辅助蛋白, 在维持机体水代谢平衡方面起重要作用, 目前已分离出至少13种哺乳动物水通道蛋白[8], 其中AQP2主要分布于肾脏。有研究发现[9], 大鼠从尿液排出的AQP2含量与肾组织AQP2含量成正比, 且几乎不受尿量的影响。因此, 检测尿AQP2可间接反映肾脏AQP2表达情况。课题组研究发现, 随着肾功能恶化, AQP2会持续性代偿表达, 增加水的重吸收, 加重水钠潴留状态, 在肾功能改善后, 尿AQP2表达情况与正常大鼠相当, 心肾综合征水钠潴留状态缓解, AQP2可作为心肾综合征水钠潴留状态的参考指标。

通过3组间AQP2和BNP、Scr的比较, 发现心肾综合征大鼠尿AQP2的表达主要由肾脏调控, 与BNP水平无关。真武汤合苓桂术甘汤可有效保护心肾功能, 延缓心肾综合征进展, 在缓解心肾综合征水钠潴留状态上有独特优势。实验发现, 常规治疗组AQP2呈高表达状态, 大鼠水钠潴留状态明显, 心肾功能状态差, 中药组AQP2表达下降且水肿减轻, 说明真武汤合苓桂术甘汤的作用机制可能是抑制了心肾综合征大鼠肾脏AQP2过度表达, 减少水的重吸收, 改善水钠潴留状态。肾脏水液代谢紊乱中可有不同程度的AQP2表达改变, 心肾综合征大鼠肾脏AQP2表达变化的发现, 加深了对该病水钠潴留状态以及机体水转运机制的认识, 可为中医"肾者主水""肾者水脏, 主津液"等理论提供科学数据支持。

中医古籍中无"心肾综合征"病名记载, 从临床特点来看, 心肾综合征类似于中医"喘证" "心水水肿" "关格"等, 水饮泛溢乃其核心。《素问》有云肾者主水" "肾者水藏, 主津液", 可见其关键病位在肾, 肾脏衰败则水失所主, 泛溢于皮腠经脉脏腑之间。然而心肾相交, 肾不独伤, 肾伤则心亦损。《黄帝内经》有云:"君火以明, 相火以位。"君火即心, 相火为肾, 心火下沉以温肾水, 肾水上升以济心火, 可见心肾关系紧密, 共荣共损。

心肾综合征的核心问题是水钠潴留, 临床主要表现为水肿、尿少、畏寒肢冷、腰膝酸软、神疲乏力、倚息喘满、腹胀食少等一派虚寒之象, 其责之于肾阳、脾阳、心阳之虚, 其中肾为元阳, 肾阳为本; 脾主运化, 则脾阳为用; 心主火, 故心阳为标, 今振肾阳温脾阳以救心阳, 故唯真武汤合苓桂术甘汤用之有效。两方均是张仲景治水名方, 其一出自《金匮要略》, 属于温脾阳而利水之剂, 有如下叙述":心下有痰饮, 胸胁支满, 目眩者, 苓桂术甘汤主之。""夫短气有微饮, 当从小便去之, 苓桂术甘汤主之……"另一出自《伤寒论》, 属振肾阳而利水之剂, 如:"少阴病, 二三日不已……此为有水气……真武汤主之。"两方合用药物固定, 疗效灵验, 今用之治疗心肾综合征的实验研究依据充分, 并可提供其临床疗效的理论支持, 拓展其应用范围。

参考文献
[1]
RONCO C, HOUSE A A, HAAPIO M. Cardiorenal syndrome:refining the definition of a complex symbiosis gone wrong[J]. Intensive Care Medicine, 2008, 34(5): 957-962.
[2]
国家卫生计生委合理用药专家委员会, 中国药师协会. 心力衰竭合理用药指南(第2版)[J]. 中国医学前沿杂志(电子版), 2019, 11(7): 1-78.
Committee of Exports on Rational Drug Use National Health, Family Planning Commission of The People'Republic of China. Guidelines for rational administration of heart failure (2nd Edition)[J]. Chinese Journal of medical frontier (Electronic Edition), 2019, 11(7): 1-78.
[3]
VALENTE M A E, VOORS A A, DAMMAN K, et al. Diuretic response in acute heart failure:clinical characteristics and prognostic significance[J]. European Heart Journal, 2014, 35(19): 1284-1293.
[4]
XU D L, MARTIN P Y, OHARA M, et al. Upregulation of aquaporin-2 water channel expression in chronic heart failure rat[J]. Journal of Clinical Investigation, 1997, 99(7): 1500-1505.
[5]
于江, 刘宇. 加味真武汤联合连续性血液净化治疗心肾综合征的临床研究[J]. 中国中医基础医学杂志, 2013, 19(9): 800-801.
YU J, LIU Y. Clinical study on the treatment of cardiorenal syndrome with Jiawei Zhenwu Decoction and continuous blood purification[J]. Journal of Basic Chinese Medicine, 2013, 19(9): 800-801.
[6]
胡文仲, 许云, 李光亚, 等. 5/6肾切除联合ISO制备心肾综合征大鼠模型方法初探[J]. 天津中医药大学学报, 2020, 39(2): 199-202.
HU W Z, XU Y, LI G Y, et al. Preliminary study on the method of preparing cardiorenal syndrome rat model by 5/6 nephrectomy combined with ISO[J]. Journal of Tianjin University of traditional Chinese Medicine, 2020, 39(2): 199-202.
[7]
徐淑云, 卞如濂, 陈修. 药理实验方法学[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2002.
XU S Y, BIAN R L, CHEN X. Experimental methodology of pharmacology[M]. Beijing: People's Health Publishing House, 2002.
[8]
ISHIBASHI K, HARA S, KONDO S. Aquaporin water channels in mammals[J]. Clinical and Experimental Nephrology, 2009, 13(2): 107-117.
[9]
RAI T, SEKINE K, KANNO K, et al. Urinary excretion of aquaporin-2 water channel protein in human and rat[J]. Journal of the American Society of Nephrology, 1997, 8(9): 1357-1362.