痤疮又称为粉刺、青春痘，是由多种因素引起的毛囊、皮脂腺慢性炎症性疾病。痤疮发病时皮肤上皮细胞受损，被破坏的毛囊口分泌出大量中性粒细胞和淋巴细胞，从而在局部产生炎症反应^[1]。皮肤中的琉基数量减少，不能抑制住酪氨酸酶，使酪氨酸酶的活性增加，促使生成更多的黑色素，遗留下暂时性或永久性的色素沉着，导致容貌损毁，从而对患者的心理构成重大的负面影响^[2-3]。因此在治疗痤疮时应将抗炎药与酪氨酸酶抑制剂合用，以达到消炎与降低色素沉着的目的。

秦皮甲素（Esculin）属于中药化学中香豆素类成分，具有抗病原微生物的作用，对金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、绿脓杆菌都有抑制作用^[4]。光甘草定（Glabridin）是光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）中的黄酮类成分之一，能够抑制黑色素的生成，具有美白的作用^[5]；能够明显抑制体内新陈代谢过程中所产生的自由基、从而可以防治细胞衰老。白藜芦醇（Resveratrol）属于多酚化合物，能通过抑制细胞内酪氨酸酶的活性，显著降低细胞内黑色素的含量，起到美白的作用^[6]。前期研究发现当白藜芦醇与光甘草定的配比为2:8时，有协同抑制酪氨酸酶的作用。3种药效成分联合使用能达到治疗痤疮，延缓衰老的目的。然而秦皮甲素、光甘草定与白藜芦醇水溶性均较差，且白藜芦醇化学性质不稳定，易被氧化分解^[7]，这些性质使该类药物在直接经皮给药时吸收效果差，并且在使用过程中容易分解。纳米乳是由水相、油相、表面活性剂及助表面活性剂按照合适的比例所形成的热力学稳定的胶体分散体系^[8]。纳米乳载药系统不仅能够增加药物的溶解性，而且也可以同时包容不同脂溶性药物，提高一些药物的稳定性。由于纳米乳制剂既是亲油性物质又是亲水性物质，与角质层脂质双分子层有很好的相容性，这种特性有助于促进药物穿透角质层，大大提高药物的透皮速率^[9]。因此，本实验将秦皮甲素、光甘草定、白藜芦醇组分配伍制成了纳米乳凝胶，外用涂抹于皮肤上治疗痤疮，同时改善由痤疮引起的粗糙老化与色素沉着。

1 材料 1.1 动物

健康成年雄性新西兰大白兔共24只，质量为（2±0.2）kg，由中国医学科学院实验动物中心提供SCXK（津）20160001。

1.2 药品及试剂

秦皮甲素对照品（中国药品生物制品检定所110740-201604），光甘草定对照品（纯度≥98%，天津一方科技有限公司Az7lG001），白藜芦醇对照品（中国药品生物制品检定所111535-201602），甲醇（色谱纯，天津市康科德科技有限公司160810），乙腈（色谱纯，天津市康科德科技有限公司160921），三乙酸甘油酯（陕西省医药公司20160909），1.2-丙二醇（天津市科密欧化学试剂有限公司20160317），葡聚糖凝胶G-25（北京索莱宝科技有限公司），吐温- 80（天津基准化学试剂供销公司20160508），卡波姆940（天津泰士康制药科技有限公司20150903），三乙醇胺（天津浩元精细化工股份有限公司20160809），甘油（天津市科密欧化学试剂有限公司20150706），油酸（天津市科密欧化学试剂有限公司20160104），光甘草定（纯度≥85%，南京普怡生物科技有限公司20160902），白藜芦醇（纯度≥85%，西安小草植物科技有限公司20160704），秦皮甲素（纯度≥90%，武汉尹和化工有限公司20150503）。

1.3 仪器

高效液相色谱仪LC-2030C（日本岛津），纳米颗粒分析仪（HORIBA），十万分之一分析天平EX225DZH（奥豪斯仪器有限公司），透射电子显微镜（Tecnai G2 F20 S-TWIN FEI），磁力搅拌器SP88857106（赛默飞世尔科技（中国）有限公司），蠕动泵BT100-2J（保定兰格恒流泵有限公司），万分之一天平（上海精密科学仪器有限公司）。

2 方法 2.1 秦皮甲素、光甘草定、白藜芦醇的含量测定 2.1.1 色谱条件

秦皮甲素的色谱条件流动相甲醇-水（20:80），流速为1 mL/min，检测波长为336 nm，Hypersil ODS色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温为25 ℃，进样量为10 μL。

光甘草定的色谱条件    流动相乙腈-水-冰乙酸（55:44:1），流速为1 mL/min，检测波长为280 nm，Hypersil ODS色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温为30℃，进样量为10 μL。

白藜芦醇色谱条件  流动相甲醇-水（45:55），流速1 mL/min，波长306 nm，Hypersil ODS色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温25 ℃；进样量5 μL。

2.1.2 标准曲线的建立

建立秦皮甲素标准曲线^[10]。精密称取秦皮甲素对照品10 mg，用甲醇完全溶解，定容到100 mL容量瓶中，得浓度为100 mg/L的母液，用甲醇稀释成质量浓度分别为80、40、20、10 mg/L的对照品溶液，使用0.45 μm的微孔滤膜过滤，按“2.1.1”项下进行色谱分析。利用Excel 2007对秦皮甲素的浓度与相应的峰面积作回归曲线，并得出相应的回归方程为Y=700 000 0X+130 5.6（r=0.999 7），表明秦皮甲素在10~100 mg/L线性关系良好。

建立光甘草定标准曲线^[11]  精密称取光甘草定对照品2.25 mg，置于25 mL容量瓶中，以甲醇定容，制得浓度为90 mg/L的对照品储备液。将对照品储备液稀释，得到一系列浓度为90、45、30、20、10、5 mg/L的光甘草定溶液，按“2.1.1”项下进行色谱分析。利用Excel 2007对光甘草定的浓度与相应的峰面积作回归曲线，并得出相应的回归方程为Y=227 46X-104 9.3（r=1），表明光甘草定在5~90 mg/L线性关系良好。

建立白藜芦醇标准曲线^[12]。精密称取白藜芦醇对照品6.28 mg于10 mL棕色量瓶内，用甲醇定容，得母液，备用。精密量取该母液适量，用甲醇稀释成质量浓度分别为10、20、50、100、300 mg/L的对照品溶液，各对照品溶液与母液（6.28 mg定容至10 mL）经0.45 μm微孔滤膜滤过，按“2.1.1”项下进行色谱分析。利用Excel 2007对白藜芦醇的浓度与相应的峰面积作回归曲线，并得出相应的回归方程为Y=725 65X+496 5.6（R²=1），表明白藜芦醇在10~628 mg/L线性关系良好。

2.1.3 精密度试验

精密量取秦皮甲素、光甘草定、白藜芦醇各母液分别连续进样6次，结果峰面积的RSD分别为0.46%、0.68%、0.57%，表明仪器精密度良好。

2.1.4 稳定性试验

精密称量秦皮甲素、光甘草定、白藜芦醇对照品适量于棕色量瓶内，用甲醇定容，在常温光照下，每隔1 h测定峰面积，结果峰面积在8 h内的RSD分别为0.75%、0.63%、0.54%，表明对照品溶液在8 h内稳定。

2.1.5 加样回收率试验

量取9份已知质量浓度的同一批纳米乳2 mL于5 mL量瓶内，分别精密加入适量的秦皮甲素、光甘草定、白藜芦醇对照品溶液，用甲醇定容，超声30 min，经0.45 μm微孔滤膜滤过，进样10 μL，测定秦皮甲素、光甘草定、白藜芦醇含量，计算平均回收率分别为98.53%、96.98%、97.45%，RSD分别为1.95%、1.32%、2.85%，表明该方法稳定可靠。

2.2 纳米乳的制备及表征 2.2.1 纳米乳的制备

将1.285 g秦皮甲素加到17.33g三乙酸甘油酯中，超声溶解，加入0.649 5 g光甘草定，然后加入6.413 g 1.2-丙二醇，超声溶解，加12.82 g吐温-80，然后加0.160 8 g白藜芦醇，超声15 min溶解。最后加入蒸馏水，边滴加边搅拌，保持滴加速度为1 mL/min，搅拌速度为300 r/min，搅拌过程中，观察溶液由透明变浑浊再变澄清，最后即得淡黄色透亮纳米乳^[6]。

2.2.2 纳米乳中秦皮甲素、光甘草定、白藜芦醇的含量测定

将“2.2.1”项下制备的纳米乳用甲醇稀释适当倍数后，按“2.1.1”项下进行色谱分析，测定秦皮甲素、光甘草定、白藜芦醇在纳米乳中的含量。

2.2.3 纳米乳中秦皮甲素、光甘草定、白藜芦醇包封率的测定

取2.5 mL一次性注射器，将玻璃棉放置在注射器底部，加葡聚糖凝胶，2 000 r/min，离心3 min，加纯化水离心，重复3次，精密移取100 μL纳米乳，置于微柱中，2 000 r/min，离心3 min，加纯化水，2 000 r/min，离心3 min，离心2次。取离心液置于容量瓶中，加甲醇定容至5 mL，50 W，超声15 min，过0.45 μm有机滤膜，HPLC测定其含量^[13]。按以上方法平行操作3次，并依照以下公式计算药物的包封率。

包封率（%）=收集的带乳光部分药物的含量/纳米乳中药物的含量×100%

2.2.4 纳米乳粒径、电位的测定

取适量纳米乳稀释，室温下，借助纳米颗粒分析仪测定纳米乳的平均粒径和Zeta电位。

2.2.5 纳米乳形态的观察

把纳米乳稀释后滴加在覆有支持膜的铜网上，静置5 min后用滤纸吸干，再滴加2%磷钨酸负染3 min，烤灯烘干后，透射电镜观察其形态^[14]。

2.2.6 纳米乳凝胶的制备

卡波姆溶胀后，加入甘油、尼泊金乙酯，待搅拌均匀后加入三乙醇胺调节pH至中性，加入上述制得的纳米乳继续搅拌，即得乳白色纳米乳凝胶。同法制备不含药的空白纳米乳凝胶。

2.3 纳米乳凝胶对兔耳痤疮模型的疗效观察 2.3.1 造模

新西兰大白兔24只，分别在兔左、右外耳道内侧耳导管开口处约2.5 cm×2.5 cm范围内涂抹油酸0.3 mL，1次/d，连续13 d，建立动物痤疮模型^[15]。

2.3.2 模型评价

造模第13 d随机取空白组与模型组动物8只，在左耳标记处取约1.5 cm×1.5 cm作皮肤活检，组织块以10%福尔马林固定，石蜡包埋，切片，每个标本作连续切片3张，HE染色，在显微镜下观察，评价造模情况。

2.3.3 给药

将造模成功的新西兰大白兔随机分为含药纳米凝胶组、空白纳米凝胶组、阳性对照Va组以及模型组，每组6只。给药，每日1次，每次1 g^[16]。

3 结果 3.1 纳米乳中秦皮甲素、光甘草定、白藜芦醇的含量测定结果

将“2.2”项下制备的纳米乳用甲醇稀释适当倍数后，按“2.1”项下进行色谱分析，色谱图见图 1，秦皮甲素、光甘草定、白藜芦醇在纳米乳中的含量，见表 1。

3.2 纳米乳包封率

纳米乳中秦皮甲素、白藜芦醇、光甘草定的包封率分别为（91.53±0.72）%、（92.85±0.37）%与（91.26±1.15）%，表明绝大部分药物被包封在油相内部。

3.3 纳米乳的粒径与电位

将纳米乳稀释后用纳米颗粒分析仪测定其粒径与电位。纳米乳的粒径为（11.5±0.26）nm，PDI为0.195±0.004，见图 2，纳米乳的Zeta电位为（-11.9±0.1）mV，见图 3。

3.4 形态观察

TEM观察纳米乳的形态时，镜下情况如图 4所示，纳米乳为规则球形，分布均匀，无聚集、黏连的小液滴。

3.5 造模结果

未涂抹油酸的兔耳柔软光滑，可见清晰的毛细血管。涂抹油酸3 d后，兔耳有发红、发热、耳肿胀的现象，第5天出现痂皮，第13天涂抹油酸的兔耳毛囊口隆起呈丘疹状，如图 5所示，提示痤疮模型建造成功。

HE染色结果显示正常组：兔耳表皮较薄，细胞排列整齐，角化正常，可见毛囊，未见毛囊融合和扩张。模型组：表皮可见角化过度或角化不全，表皮和毛囊上皮颗粒层增厚、棘层肥厚，相邻扩张的毛囊相互融合，毛囊口及漏斗部充满角化物质，毛囊漏斗部扩大呈壶状，真皮浅层毛细血管扩张，毛囊周围可见大量中性粒细胞浸润，见图 5，提示痤疮模型建造成功。

3.6 给药结果

给药7 d后，含药纳米凝胶组、空白纳米凝胶组、阳性对照Va组与模型组的痤疮情况相比较，含药纳米凝胶组和阳性对照Va组痤疮有明显好转，痤疮程度减轻，表面平滑，已接近正常组织，空白纳米凝胶组和模型组痤疮仍存在，自愈部分表面均留下了不同程度的斑痕，如图 6所示。结果显示本实验制得的含药纳米凝胶对于痤疮及留下的斑痕有良好的治疗作用。

4 讨论

据报道，痤疮的发病机制与细菌、遗传、内分泌障碍及情绪等因素有关^[17]。目前认为表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、大肠杆菌与痤疮的发病密切相关^[18]。目前治疗痤疮的化学药物副作用大，如维A酸类药物具有致畸性，在临床上限制了其使用，传统中药对痤疮治疗效果好，但由于使用不方便，限制了其发展，本文将中药中有效成分配伍制成凝胶剂，不但起到了协同增效的作用，而且还方便了日常的使用。

光甘草定的用量为0.001%~3%时，可达到美白抗衰的效果，外用光甘草定有很好的抗氧化和抑制酪氨酸酶的作用，能淡化皱纹和色斑，当用量为0.01%~0.5%时，还有治疗痤疮的作用。白藜芦醇不仅能够抑制酪氨酸酶的活性，起到美白的作用。还对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有良好的抑菌作用，能治疗炎症。本实验经过前期研究发现当白藜芦醇与光甘草定的配比为2:8时，对酪氨酸酶的活性有很好的抑制作用。因此，本实验采用2:8的比例，同时联合抗炎效果良好的秦皮甲素，达到治疗痤疮、皮肤粗糙老化，淡化色斑的作用。

5 结论

秦皮甲素、光甘草定及白藜芦醇组分配伍制备的纳米乳为分布均匀，无聚集、无粘连的小液滴，该纳米乳凝胶对兔耳痤疮模型具有良好的治疗作用。