膝骨关节炎（KOA）是一种老年人中常见的退行性疾病，以关节软骨变性，滑膜炎症、关节软骨下骨的变化为主要特点^[1-2]。虽然有很多导致KOA发生的因素，包括关节损伤、遗传、肥胖、老化、生物力学和炎症等^[3-4]，但其发病机制复杂，至今尚未完全清楚。人工关节置换术（TJA）是一种有效的治疗晚期骨性关节炎的治疗方法。然而，该方法伴随着相应的风险，如感染、假体周围骨折、下肢深静脉血栓形成、关节脱位等。因此，继续深入研究骨关节炎发病机制，有助于寻找新的治疗靶点和治疗方法，具有重要的临床和临床研究的重要作用。TLR2、TLR4是Toll样受体（TLR）家族重要成员，在促炎症因子、基质金属蛋白酶等导致的骨关节炎软骨退变病理进程中起重要的介导作用, 对软骨细胞凋亡、细胞外基质代谢失衡具有关键作用。通络止痛方是治疗KOA的经验方，具有通络止痛，活血化瘀的功效，通过超声促透外治法治疗KOA可有效减轻患者疼痛、改善膝关节功能^[5]。但其作用机制尚不明确，本实验将不同浓度通络止痛方作用于人KOA滑膜炎症细胞，通过对Toll样受体通路的影响，探讨该方的作用机制，为其治疗KOA提供支持。具体报告如下。

1 材料和方法 1.1 组织来源

人KOA炎性滑膜组织源于北京中医药大学第三附属医院行关节置换治疗的KOA患者废弃滑膜组织。无菌条件下将取得的滑膜组织去除脂肪、纤维等，加入PBS洗涤，PBS清洗两次后放在无菌小青霉素瓶中用解剖剪切碎成糊状。置于2 mL 0.4%Ⅰ型胶原酶的25 cm²培养瓶中消化2.5 h（期间摇匀数次）。经200目金属筛过滤。取未黏附的细胞移至离心管中，用2 000 r/min离心5 min，弃上清，加入含有10%胎牛血清的RPMI－1640培养基, 反复吹打后将细胞接种在25 cm²的培养瓶中，置于37 ℃，5%CO₂培养箱中。1~2 d换液1次，选取3~4代细胞，纯度大于98%，经鉴定后用于实验。

1.2 主要试剂与仪器

胎牛血清，购自四季青公司；RPMI－1640培养基、胰蛋白酶－EDTA消化液（0.25%）、Ⅰ型胶原酶，均购自Gibco公司；PE-anti-human-TLR4、FITC -anti-human-TLR2，美国eBioscience公司；Trizol，美国Sigma公司；RNA逆转录试剂盒（TOYOBO），SYBR Green Real-time PCR Master Mi×（TOYOBO），5×LoadingBuffer（TAkara），DNA MARKER B（上海生工）；发光液，普利莱基因技术公司；羊抗兔IgG/HRP，美国Sigma公司；TLR4抗体，abcom；TLR4引物均由北京百诺威生物科技有限公司出品；流式细胞仪，美国BD公司FACS Calibur；4 ℃低温高速离心机，美国Thermo；ELX800型酶联免疫检测仪，美国生物技术仪器公司；CO₂培养箱，美国Thermo Scientific; 四环冻干机，北京四环科学仪器厂有限公司。

1.3 药物制备及剂量

通络止痛处方组成：桂枝100 g，白芍60 g，桃仁50 g，红花50 g，制草乌10 g，细辛3 g，川椒20 g，牛膝20 g，乳香30 g，没药30 g；购于北京中医药大学第三附属医院药房。将上述中药饮片按成方比例置煎煮容器内，加水浸泡，煮沸30 min，弃药渣取汤剂，经过离心机2 000 r/min离心，弃药渣取汤剂，利用冷冻干燥机进行冷冻干燥，粉末状，PBS溶解，用0.22 μm微孔滤器过滤除菌，配制成高、中、低浓度：高浓度组：2.5 mg/mL；中浓度组：0.25 mg/mL；低浓度组：0.025 mg/mL；对照组：0 mg/mL（培养液）。-20 ℃储存备用。

1.4 观察项目及检测方法 1.4.1 流式细胞术（FCM）检测细胞中TLR2、TLR4表达情况

1）采用细胞免疫荧光直接标记法，样品中依次加入PE-抗人TLR4单克隆抗体和FITC-抗人TLR2单克隆抗体两种荧光标记抗体，振荡器充分混匀。2）室温避光染色15 min。3）1 500 r/min，离心6 min，如此反复PBS洗3遍，将细胞碎片及未结合的荧光标记抗体去除。将细胞密度调整为1×10⁶个/mL上机。流式细胞仪检测采用SSC和FSC设门，测定10 000个滑膜细胞中TLR4、TLR2阳性表达百分率，用FACSDiva Version 6.1.3软件对数据获取及分析。

1.4.2 实时定量荧光PCR检测TLR4 mRNA的基因表达

将培养瓶从培养箱中取出，弃上清液，铺板，加入不同浓度通络止痛方，对照组加入培养液。继续放入培养箱中培养过夜。用Trizol提取滑膜组织总RNA，检测其纯度及完整性后将RNA逆转录合成cDNA，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。将北京百诺威公司提供内参GAPDH及上下游引在样品液中加入各1 μL，引物序列见表 1。反应体系25 μL，经过95 ℃预变性2 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，60℃延伸30 s，扩增35个循环后70 ℃延伸10 min进行荧光检测，由电脑自动分析并计算出反应体系中待测样品c DNA达到设定阈值的循环数（CT值）并计算2^-ΔΔCT值，其中，ΔΔCT=（Cttarget－CtGAPDH）加药组－（Cttarget－CtGAPDH）对照组。

1.5 统计学方法

应用SPSS 20.0软件进行统计学处理。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两组数据采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 流式细胞术（FCM）检测细胞中TLR2、TLR4表达情况

高、中、低浓度通络止痛方组TLR4表达率与对照组比较都有明显的降低（P＜0.05）, 且随着浓度升高，TLR4的表达率逐渐降低；高、中、低浓度通络止痛方组TLR2表达率与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表 2。高、中、低浓度组通络止痛方FSC-SSC散点图圈定细胞图与TLR2、TLR4的表达率流式图见图 1~8。

2.2 实时定量荧光PCR检测TRL4 mRNA的基因表达

与对照组比较，高、中、低浓度组中，人膝骨关节炎滑膜炎症细胞TLR4的表达水平显著降低（P＜0.05）。低浓度组通络止痛方对滑膜炎症细胞TLR4抑制作用与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。高、中浓度组抑制作用与浓度呈正比。结果见图 9。

3 讨论

KOA属中医学的“骨痹”范畴^[6]，是由多种因素引起的关节软骨变性、破坏及增生和关节周围软组织炎症等为特征的一种慢性关节疾病，老年人中常见病，严重影响着国民的生存质量。尽管如此，KOA发病机制还不清楚发病机制复杂，并且到目前为止，还没有一种治疗方法可以从根本上预防、改变或中止KOA的疾病进程^[7]。人类TLR是一类信号转导跨膜受体位于细胞表面，可对入侵病原微生物的识别在固有免疫中发挥重要作用。TLR家族可以按其细胞定位及配体分为两个亚群，一种亚群分布于细胞膜表面，以外均识别以脂质为基础的配体，包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、LR6和TLR10；一种亚群则识别以核酸为基础分布在内体、溶酶体以及内质网等细胞器上的配体，包括TLR3、TLR7、TLR8和TLR9。TLR4、TLR2是最早被发现的TLR家族成员，是介导天然免疫和炎症反应的一种主要模式识别受体，在细菌感染和自身免疫性疾病中起重要作用。TLR4、TLR2是与骨关节炎最有关联性TLRs的家族成员其中之一，同所知道的TLRs其他家族成员类似，TLRs启动和激活的信号传输和诱导归于常规Toll的样信号路径，能够开启NF-κB路径和应激激酶路径，激发炎症因子包括白细胞介素（IL）－1β、肿瘤坏死因子（TNF）、蛋白聚糖酶（aggrecanases）、转化生长因子TGF、基质金属蛋白酶（MMPs）等^[8]，最终产生炎症表现。它可以通过模式识别受体识别病原相关分子模式或内源性危险相关分子模式并与之结合后被激活。最近几年来研究证实，固有免疫应答在诱发KOA滑膜炎症反应中有着重要作用，TLRs介导的滑膜细胞固有免疫应答是促进KOA滑膜炎的关键环节^[5-6]。

本课题组曾做过应用四甲基偶氮唑盐法（MTT）法检测不同浓度通络止痛方对KOA滑膜细胞增殖活性的影响^[9]。人KOA炎性滑膜组织源于本院行关节置换治疗的KOA患者废弃滑膜组织。原代培养细胞4 h可见细胞贴壁，见图 10，细胞成星状，通过3~4条树突与培养瓶相贴，细胞器不明显，细胞密度稀疏。随培养时间至3~4代细胞，见图 11，形态成滑膜成纤维细胞呈梭形、树突样，胞核狭长，增殖旺盛, 细胞器可见。其形态特点符合滑膜炎症细胞的形态学特点。将通络止痛方分为高、中、低浓度，和空白对照组，高浓度组：10/42、10/43、10/44 mg/mL；中浓度组：10/45、10/46、10/47 mg/mL；低浓度组：10/48、10/49、10/410 mg/mL；并设立空白组：0 mg/mL，应用MTT法检测干预后KOA滑膜细胞的增殖水平，结果显示，通过止痛方可以对滑膜成纤维细胞增殖产生影响，高中浓度组通络止痛方抑制率为正值，随浓度增加抑制率增大，低浓度抑制率为负值，随浓度减低抑制率减少。在抑制率为正值的通络止痛方浓度中将其按稀释浓度比例分为高、中、低浓度组，为本实验的研究浓度。

在探究通络止痛方整体的作用机制方面。取全膝关节置换术患者术中废弃滑膜组织培养成纤维细胞进行不同浓度浓度通络止痛方干预，用以观察通络止痛方对人膝骨关节炎滑膜炎性细胞TLR4及1L-1β的影响，认为通络止痛方可能通过Toll样受体通路影响或抑制人膝骨关节炎滑膜炎性反应。还观察通络止痛方对人膝骨关节炎滑膜炎症细胞上清1L-1β和TNF-α含量的影响，认为通络止痛方对人膝骨关节炎滑膜炎症细胞上清1L-1β和TNF-α有抑制作用，随浓度增高，抑制程度越明显。探讨了通络止痛方对人KOA滑膜成纤维细胞增殖的影响。认为高、中浓度通络止痛方对滑膜细胞增殖有抑制作用，低浓度组的通络止痛方对滑膜细胞有增殖有促进作用。

本实验运用FCM，real-time PCR检测技术验证了通络止痛方可以抑制Toll样受体通路上重要成分TLR4、TLR2的表达，在一定程度上说明了通络止痛方的作用机制，以及Toll样受体通路在骨关节炎发生发展中的重要作用。KOA的病理发展是一个复杂的过程，并非一两个细胞因子作用的结果，但是Toll样受体通路有可能成为KOA诊断和治疗的一项有用的指标，并且可能为KOA的治疗提供一个新的靶点。通过通络止痛方干预Toll样受体的信号转导通路或抑制其生物活性，将为治疗骨性关节炎开辟一条新的途径。