异补骨脂素是呋喃香豆素类化合物，中国药典将其和补骨脂素作为补骨脂的质量控制成分^[1]。异补骨脂素具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒和促进骨生成等多方面的药理作用^[2-5]；通过抑制NF-κB的活性减轻炎症反应并下调TGF-β1表达，缓解人正常肝细胞损伤，并改善非酒精性脂肪肝^[6]；能够增加人真皮成纤维（HDF）细胞TGF-β1、Smad3、COL1A1蛋白及mRNA表达，从而促进光老化HDF细胞胶原合成^[7]；异补骨脂素还可抑制肿瘤细胞增殖，并诱导细胞凋亡^[8]；还可通过上调表达雌激素ERα，显著减少脊髓损伤区域灰质前角运动神经元凋亡坏死面积，促进神经元细胞修复等^[9]；异补骨脂素可以促进骨形成，增加大鼠骨密度，改善骨组织微结构，有效提升骨生物力学性能^[10]。有报道称，摄入异补骨脂素28 d可能会影响小鼠的新陈代谢和排泄^[11]。前期已有异补骨脂素后药物在大鼠体内的代谢研究^[12]，发现异补骨脂素在大鼠体内代谢过程属于非线性药代动力学。但对异补骨脂素在不同性别大鼠血浆内的代谢过程是否存在差异尚不明确，为此，本实验进行了异补骨脂素单次灌胃给药后雌性和雄性大鼠体内的药代动力学比较研究。

1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 动物

SPF级SD大鼠，体质量200~220 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。动物许可证号：SCXK（京）2016-0006。

1.1.2 药品与试剂

异补骨脂素，批号：20150815，天津月牙湖生物科技有限公司；蛇床子素，批号：110822-201609，中国食品药品检定研究院；黄蓍树胶粉，北京Solarbio公司；甲醇、乙腈，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.1.3 仪器

超高效液相色谱仪，美国Waters；低温高速离心机（LEAGENO MICRO 21 R），美国Thermo；离心浓缩仪，德国Eppendorf。

1.2 实验方法 1.2.1 色谱条件

色谱具体条件如下：ACQUITY C₁₈色谱柱（规格1.7 μm，2.1 mm×100 mm），流动相水（A）-乙腈（B），流速0.3 mL/min，进样体积10 μL，检测波长246 nm，洗脱梯度0~2 min，26%~34%B；2~4 min，34%~60%B；4~5 min，60%B；5~7 min，60%~26%B；7~9min，26%B。

1.2.2 分组、给药及样品采集

按体质量随机将48只大鼠随机各分成4组，每组雌性和雄性各6只；分别单次灌胃给予7、14、28、56 mg/kg的异补骨脂素。在给药前和给药后的12个采血点，即0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、12、16、24、36 h进行眼内眦穿刺取血，血液置于加有适当肝素钠溶液的1.5 mL离心管中，摇匀。以3 500 r/min离心10 min，分离血浆，储存于-20 ℃冰箱备用。

1.2.3 血浆样品的处理

将血浆样品解冻，取100 μL于1.5 mL离心管中，加入10μL内标溶液（蛇床子素浓度50 μg/mL，涡旋30 s，加入900 μL甲醇，涡旋3 min，使蛋白质完全沉淀，8 000 rpm离心10 min，取上清液于新的1.5 mL离心管中，挥干溶剂，加入200 μL流动相复溶，12 000 rpm离心10 min，取上清液170 μL于液相小瓶中，进样。

1.2.4 对照品溶液的配制

分别精密称取异补骨脂素和蛇床子素对照品1mg，加入甲醇，分别配成浓度为1mg/mL储备液，置于4℃冰箱中备用。

1.2.5 统计学处理

用SPSS 19. 0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）或均数±标准误（Mean±SEM）表示，组间比较采用独立样本t检验。采用DAS3. 0软件中的统计矩法计算药代动力学参数。

1.2.6 方法学考察 1.2.6.1 专属性

取大鼠空白血浆，按“2.2血浆样品的处理”项下操作，得空白血浆色谱图；取大鼠空白血浆分别加入一定量的异补骨脂素和蛇床子素，按“2.2血浆样品的处理”项下操作，得血浆对照品色谱图；取给药后0.75 h大鼠血浆样本，按“2.2血浆样品的处理”项下操作，得血浆样品色谱图。

1.2.6.2 线性关系

精密吸取适量浓度为1 mg/mL的异补骨脂素储备液，加入适量甲醇，稀释浓度为0.05、0.2、1、5、10和20 μg/mL一系列对照品溶液。分别吸取上述对照品溶液200 μL，挥干溶剂，加入100 μL空白血浆，按“2.2血浆样品的处理”项下操作，进样分析。以标准品峰面积与内标峰峰面积比值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，作回归曲线，计算得线性回归方程。

1.2.6.3 日内精密度和日间精密度

精密吸取大鼠空白血浆100 μL，加入标准品溶液，使异补骨脂素浓度分别为0.5、2、10 μg/mL，按“2.2血浆样品的处理”项下操作，将样品与内标峰面积的比值带入同一曲线中计算得到药物浓度。每个质量浓度重复进样3次测定日内精密度，连续进样3 d测定日间精密度。

1.2.6.4 回收率

精密吸取大鼠空白血浆100 μL，加入标准品溶液，使异补骨脂素浓度分别为0.5、2、10 μg/mL，按“2.2血浆样品的处理”项下操作，每个质量浓度3个样品，测得相应峰面积为Aa；另精密吸取大鼠空白血浆100 μL，不加内标，按“2.2血浆样品的处理”项下，处理至挥干溶剂后，加入标准品溶液，使异补骨脂素浓度分别为0.5、2、10 μg/mL，加入内标溶液10 μL，每个质量浓度5个样品，测得相应峰面积为Ab；两次峰面积求比值，计算提取回收率。

1.2.6.5 稳定性

精密吸取大鼠空白血浆100 μL，加入标准品溶液，使异补骨脂素浓度分别为0.5、2、10 μg/mL，按“2.2血浆样品的处理”项下操作。样品于-20 ℃冻存，复溶后24 h处理，3次冻融循环后处理，冻存10 d后处理，进样检测，评价样品稳定性。

2 结果 2.1 方法学验证 2.1.1 专属性

空白血浆色谱图，血浆对照品色谱图，血浆样品色谱图，见图 1。异补骨脂素和蛇床子素的保留时间分别为2.8 min和5.5 min。

2.1.2 线性关系

以标准品浓度与内标浓度比值为横坐标（X），以标准品峰面积与内标峰峰面积比值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，线性回归方程为=0.430 8X+0.004 6，r²=0.999 3。结果表明，异补骨脂素含药血浆在0.05~20 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.3 日内精密度和日间精密度

低、中、高3个浓度的日内精密度和日间精密度结果见表 1，RSD均小于5%。说明该方法的日内精密度和日间精密度均符合要求。

2.1.4 回收率

异补骨脂素低、中、高3个浓度的平均回收率分别为88.07%，70.42%和90.57%，均大于70%；RSD%分别为2.18%，4.28%和2.01%，回收率较高。

2.1.5 稳定性

异补骨脂素在3次冻融循环后处理、样品复溶后上清液室温放置24 h后进行处理和样品于－20 ℃超低温冰箱中放置10 d后处理的状态下，低、中、高3个浓度的测定结果为0.51±0.02，2.08±0.08和10.62±0.6；RSD%分别为3.76%，3.48%和5.65%，均显示出较好的稳定性。

2.2 血药浓度-时间曲线

给予大鼠单次灌胃4个不同浓度异补骨脂素后，雌性体内血药浓度明显高于雄性大鼠，尤其7、28和56 mg/kg剂量下，不同性别大鼠血药浓度曲线间距较大，见图 2。

2.3 药代动力学参数

结果显示，7 mg/kg和28 mg/kg剂量给药后，雌性大鼠的AUC_0-t，AUC_0-∞和C_max显著高于雄性大鼠；而14 mg/kg和56 mg/kg剂量下，也是雌性大鼠高于雄性大鼠，但无显著统计学差异。雄性大鼠CLz/ F明显高于雌性大鼠，同样是7 mg/kg和28 mg/kg剂量时，雌雄之间有统计学差异。

3 讨论

给予大鼠不同剂量的异补骨脂素后，C_max与AUC都未与剂量呈比例关系，与前期研究^[12]结果一致，在此实验研究计量范围内，给予异补骨脂素后药物在大鼠体内的过程属于非线性药代动力学。给予异补骨脂素剂量为7 mg/kg后，雌性大鼠的AUC_0-t为（6 303.48±2 993.49）μg/（L·h），约是雄性大鼠的5.2倍，剂量为28 mg/kg雌性大鼠的AUC_0-t为（5 2456.10±21 248.85）μg/（L·h），约是雄性大鼠的4倍，且7 mg/kg及28 mg/kg剂量组存在统计学差异（P < 0.01）。由于动物个体具有差异性，药代动力学参数差异较大，故14 mg/kg及56 mg/kg剂量组雌性AUC_0-t与雄性相比无统计学差异，但雌性大鼠AUC_0-t均值也较雄性大鼠增大，异补骨脂素给药剂量为14 mg/kg时，雌性大鼠的AUC_0-t为（16 070.48±7 293.76）μg/（L·h），约是雄性大鼠的1.4倍，剂量为56 mg/kg，雌性大鼠的AUC_0-t为（57 012.07±32 584.51）μg/（L·h），约是雄性大鼠的2倍。异补骨脂素在雌鼠体内的清除率小于雄鼠，在7 mg/kg及28 mg/kg剂量时具有统计学差异（P < 0.05，P < 0.01）。此外，在雌鼠体内的达峰时间T_max较雄鼠有所延长，其中28 mg/kg剂量组具有统计学差异（P < 0.05）。以上结果表明，异补骨脂素在雌性大鼠体内达峰浓度高和药物暴露量高于雄性大鼠，且药物的清除速率较低。这种体内处理过程的差异，可能与不同性别动物之间体内P450、SULT等药物代谢酶水平差异、转运蛋白和调节受体的差异有关^[13-17]，但其具体机制尚待研究。但无论如何，当前研究提示，异补骨脂素在雌性大鼠体内可能更容易出现蓄积，雌性大鼠对异补骨脂素毒性的敏感性高于雄性大鼠，这也可以帮助解释前期研究发现的补骨脂、异补骨脂素对雌鼠的毒性强于雄鼠的现象。

药物在体内代谢的差异是广泛存在的常见现象，不少药物在不同性别人群的作用强度也有所差异，研究显示近半药物的毒性存在性别差异，而这却常常被人们忽视。目前的研究已经提示，异补骨脂素的毒性、代谢存在一定性别差异，因此，进一步系统研究异补骨脂素在不同性别的吸收、分布及代谢途径的差异和毒性的相关性是十分必要的。这可以为提高临床补骨脂使用的安全性提供基础研究数据。