心脏X综合征（CSX）是指具有典型心绞痛症状，发作时心电图有心肌缺血表现和（或）运动平板试验阳性，而冠脉造影正常并可除外冠脉痉挛的一类临床综合征^[1]。临床上具有典型劳累性心绞痛症状的患者中，有10%~30%冠脉造影完全正常，可能患CSX^[2]。有数据表明超过40% 的CSX患者因为胸痛多次住院，30%在1~5年中再次行冠状动脉造影术^[3]，严重影响了生存质量；且与一般人相比，CSX患者有更高的心肌梗死与脑卒中的发生率^[4]。

中医学古代文献中并未见到专门针对CSX的记载，鉴于该类患者多有典型的胸痛症状，多数学者认为本病当归属于“胸痹”“心痛”范畴。CSX现代医学缺乏有效治疗方法，中医辨证治疗显示出一定的疗效优势。理气化痰活血方为天津中医药大学第一附属医院毛静远教授经验方剂，主要由柴胡、枳壳、瓜蒌皮、薤白、茯苓、白术、陈皮、川芎、当归、丹参、延胡索、红花等组成，用于CSX气滞痰阻血瘀证患者。临床研究证实^[5-6]，理气化痰活血方药可有效缓解CSX患者心绞痛症状，提高运动耐量，改善预后。由于中药及其复方成分复杂，使其治疗疾病的作用机制不明确。网络药理学是将药物作用网络与生物网络整合在一起，分析药物在此网络中与特定节点或模块的相互作用关系，从而理解药物和机体相互作用的科学^[7]，从整体观角度认识药物与疾病间的相互作用^[8]。本文运用网络药理学探讨理气化痰活血方治疗CSX的可能的作用机制。

1 方法 1.1 理气化痰活血方化学成分的筛选

运用中药系统药理学数据库分析平台（http://tcmspw.com/tcmsp.php）TCMSP，筛选理气化痰活血方中柴胡、枳壳、瓜蒌皮、薤白、云苓、白术、陈皮、川芎、当归、丹参、延胡索、红花的化学成分。药物在人体内要经过吸收、分布、代谢和排泄（ADME）过程才能到达靶器官发挥其治疗作用，基于口服生物利用度（OB）、类药性（DL）是筛选药物的关键参数，以ADME参数中的OB≥30%、类药性DL≥0.18为限制条件进行初步筛选，汇总结果，去除重复、删除没有相关信息的化学成分，即为理气化痰活血方治疗CSX相关的化学成分。

1.2 理气化痰活血方潜在靶点的收集及网络的构建

根据已筛选的理气化痰活血方全方中药的化学成分，通过TCMSP平台检索与化学成分相关的潜在靶点，并通过Uniprot数据库将预测出的靶点名转换为基因名。将筛选的潜在靶点导入Cytoscape3.5.1软件，构建“中药-化学成分”“化学成分-潜在靶点”网络图。

1.3 CSX相关靶点的筛选

利用TTD 4.3.02（https://db.idrblab.org/ttd/）^[9]、Drugbank 5.0（https://www.drugbank.ca/）^[10]、DisGeNET v5.0（https://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）^[11]数据库收集与CSX相关的靶点，并利用String数据库对其靶点进行扩充，删除假阳性和重复基因，最终确定280个CSX靶点。

1.4 理气化痰活血方治疗CSX网络图构建

对挖掘得到的疾病靶点与药物靶点进行Venn分析，筛选出两者共同靶点，运用Cytoscape3.5.1建立“化学成分-靶点-疾病”网络图。其中的节点代表化合物、靶蛋白或疾病，边代表这些节点之间的相互关系，即某个化学成分与靶点或靶点与疾病之间的联系。

1.5 蛋白-蛋白相互作用网络构建

将筛选得到的共同靶蛋白导入String数据库，构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络模型，将物种设置为“Homo sapiens”，为确保数据的可靠性，蛋白最低相互作用阈值设为“highest confidence”（＞0.9），对蛋白相互作用进行筛选，将结果保存成TSV格式，保留文件中node1、node2和Combined score数据并导入Cytoscap3.5.1软件，分析蛋白相互作用网路，并保存分析结果，使用Cytoscape中的Generatestyle from statistics工具，设置节点大小和不同颜色用于反映自由度的大小，边的粗细及不同颜色用于反映结合的大小，获得最终的蛋白相互作用网络图^[12]。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

采用DAVID（Version 6.8）（https://david.abcc.ncifcrf.gov/）在线分析数据工具对共同靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，阐明理气化痰活血方治疗CSX的作用机制。

2 结果 2.1 理气化痰活血方化学成分的筛选

本研究通过TCMSP数据库对理气化痰活血方12味中药的化学成分进行检索，以OB≥30%、DL≥0.18为参数进行初步筛选，结果为柴胡17个、枳壳5个、瓜蒌皮11个、薤白11个、茯苓15个、白术7个、陈皮5个、川芎7个、当归2个、丹参65个、延胡索49个、红花22个，删除重复成分21个，剔除没有相关信息成分30个，共有165个化学成分。化学成分-靶点网络图，见图 1，共包括448个节点，黄色椭圆代表 12味中药的靶点，红色、绿色、蓝色椭圆分别代表丹参、延胡索、柴胡的化学成分，蓝色、绿色、红色三角形分别代表瓜蒌皮、茯苓、红花的化学成分，红色、蓝色长方形分别代表薤白、陈皮的化学成分，蓝色、红色V形分别代表川芎、白术的化学成分，黄色菱形代表部分中药共同的化学成分。

2.2 理气化痰活血方与CSX相关靶点网络图与PPI网络构建

将280个疾病靶点与268个药物靶点输入Venny 2.1软件得到35个共同靶点。将共同靶点导入Cytoscape3.5.1软件，建立“中药-共同靶点-疾病”网络图，见图 2。黄色代表共同靶点，红色代表中药，蓝色节点代表疾病。将35个共同靶点导入string数据库进行PPI分析，将结果导入Cytoscape软件进行拓扑分析。自由度、介数是常见的拓扑结构参数，自由度越大说明其生物学重要性越强，介数越大说明该节点在网络中越重要。如图 3所示，该网络由30个节点、85条边组成，节点的大小由自由度决定，自由度越大，节点越大；节点颜色根据自由度进行设定，颜色从蓝色逐渐到黄色的改变自由度逐渐增大；边的粗细由介数决定，介数越大，边越粗。

2.3 GO富集分析

GO富集分析包括分子功能（MF）、生物过程（BP）和细胞组分（CC）3个分支。对理气化痰活血方与CSX的共同靶点进行GO生物学过程分析，以P < 0.01为筛选条件，取P值最小的前20个生物学过程，见表 1。

2.4 KEGG通路富集分析

利用DAVID对共同靶点进行KEGG通路富集分析，共获得96条富集结果，以基因数≥2个，P＜0.05为筛选条件，理气化痰活血方治疗CSX相关的信号通路有25条，见表 2。从表中可以看出，每条信号通路有多个靶点，同一靶点又在多条通路上，这提示理气化痰活血方通过多通路、多靶点治疗CSX且这些通路、靶点之间存在着复杂的相互作用关系。对富集在通路的基因构建“化合物-基因-通路-疾病”网络，见图 4。此网络共有156个节点，包括25个通路节点（黄色椭圆），24个富集在25条通路上的基因节点，106个化合物节点，1个疾病节点。其中槲皮素（quercetin）、柚皮素（Naringenin）、川陈皮素（nobiletin）、山奈酚（kaempferol）等化合物在网络中度值较大，这些化合物可能在理气化痰活血方治疗CSX发挥关键作用。

3 讨论

CSX又称为微血管性心绞痛，其发病机制尚不十分清楚，目前的研究结果认为CSX与冠脉微血管结构的改变、血管内皮功能障碍、炎症反应、心脏自主神经功能异常、雌激素水平不足有关，其中，冠脉微循环功能障碍被认为是导致的主要原因，心脏微血管内皮细胞功能障碍是CSX的主要病理机制，炎症、心脏微血管内皮细胞功能障碍可促进微CSX的发展^[13-14]。内皮细胞通过释放内皮素-1等收缩因子和一氧化氮等舒张因子改变冠状动脉血管的扩张程度，影响心脏血管的管腔容量，进而引起冠脉微循环的改变，引发CSX相关的胸痛及ST段改变；炎性因子可以激活内皮细胞分泌功能和引发血管内皮功能异常，促进细胞黏附分子、炎症细胞因子等表达增加，加重冠状动脉微循环障碍；交感神经系统激活可以增加缩血管物质，也可提高阻力小动脉对缩血管物质的敏感性，加重冠脉微循环障碍^[14]。CSX作为最具代表性的冠状动脉微循环障碍相关心脏疾病，目前西医治疗主要采用冠心病的常规药物治疗，作用机制以扩张微血管、增加冠状动脉血流^[15-16]、改善心肌缺血^[17]、抗血小板聚集、抑制血栓形成^[18]为主，但长期疗效尚未得到充分肯定。

临床随机对照试验结果表明，理气化痰活血方药能有效改善CSX患者临床状况^[5]。前期研究发现，理气化痰活血方可减少大鼠冠脉微血管血栓形成，改善血管内皮功能，减轻内皮损伤后的炎症反应，改善大鼠冠脉微循环功能障碍^[19]。方中柴胡、枳壳、瓜萎皮、薤白解郁理气宽胸，为君药；川芎、当归、丹参、延胡索、红花行气活血止痛，为臣药；佐以茯苓、白术、陈皮健脾化痰，共奏理气宽胸、化痰通络、活血化瘀之功。现代药理研究发现，柴胡皂苷^[20]可以抑制多种炎症反应；陈皮、茯苓、红花具有抗炎、降血脂、抑制血小板聚集的作用^[21-23]；延胡索具有扩张冠脉血管、抗血栓、抗心肌缺血的作用^[24]；枳壳可抑制毛细血管脆性抗炎、降血脂^[25]；当归提取物可以扩张冠状动脉，改善血液循环，抗心肌缺血^[26]；瓜蒌皮、薤白具有抗炎、抗氧化、抗心肌缺血、抗血小板聚集的作用^[27-28]；丹参^[29]可以保护血管、改善微循环、抗动脉粥样硬化、抗炎、抗心律失常；白术^[30]具有降低心肌耗氧量、改善血液循环的作用；川芎^[31]可以抑制动脉粥样硬化、抗心肌缺血、舒张血管、改善冠脉微循环、抗血小板聚集。

通过对35个靶蛋白进行PPI分析发现，TNF、JUN、IL6、RELA、CXCL8、VEGFA、IL1B等靶蛋白度值大，而且这些关键靶蛋白与炎症相关，说明这些靶蛋白在理气化痰活血方治疗CSX过程中发挥着关键的作用，揭示了理气化痰活血方可能通过抗炎、抗氧化、保护血管内皮等多途径治疗CSX。通过分析“化合物-基因-通路-疾病”网络，发现槲皮素、柚皮素、川陈皮素、山奈酚等化合物在网络中度值较大，推测这些化合物可能是理气化痰活血方治疗CSX的关键化合物。槲皮素是红花、延胡索、薤白、柴胡的化学成分，柚皮素是陈皮、薤白、枳壳的化学成分，川陈皮素是陈皮、枳壳的化学成分，山奈酚是红花、柴胡的化学成分，现在药理研究发现，槲皮素具有抗炎、抗氧化、扩张血管降血压、防治冠心病、防治心肌缺血/再灌注损伤、抗血栓形成等多种功效，其可通过调控PI3K/Akt信号通路对血管内皮祖细胞发挥保护作用^[32]，柚皮素具有抗炎、抗氧化、抗纤维化、抗心律失常、预防动脉粥样硬化等多种药理活性^[33]，川陈皮素是具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗血栓形成等药理作用^[34]，山奈酚具有抗炎、抗氧化、可清除氧自由基、减轻组织因缺氧引起的损伤等^[35]。

GO富集分析结果显示，理气化痰活血方治疗CSX主要涉及细胞增殖与凋亡、物质代谢、炎症反应、内源性刺激反应、激素分泌等生物学过程；有蛋白、受体、转录因子、激素、信号分子等多种物质参与，提示理气化痰活血方治疗CSX是一个十分复杂的生物学过程。

KEGG通路富集分析结果显示，理气化痰活血方治疗CSX的26条信号通路中，与炎症反应相关的信号通路有8条，包括TNF信号通路（TNF signaling pathway）、IL-17信号（IL-17 signaling pathway）、Toll样受体（TLRs）信号通路（Toll-like receptorsignaling pathway）、NOD样受体信号通路（NOD-like receptor signaling pathway）、T细胞受体（TCR）信号通路（T cell receptor signaling pathway）、核因子κB（NF-κB）信号通路（NF-kappa B signaling pathway）、RIG-I样受体信号通路（RIG-I-like receptor signaling pathway）、AMPK信号通路（AMPK signaling pathway）。TNF-α是人体内介导炎症反应、调节细胞和体液免疫的主要细胞因子，其血清水平可以反应机体炎症反应状况^[36]；TLRs是一种Ⅰ型跨膜蛋白受体，其可通过参与炎症反应和细胞凋亡、调节免疫反应、稳定斑块及重塑血管等过程影响动脉粥样硬化^[37]。T淋巴细胞通过TCR与抗原呈递细胞相互作用，激活下游信号通路，引起T淋巴细胞激活并释放促炎性细胞因子，加重血管炎症反应从而导致动脉粥样硬化等疾病的发生^[38]；NF-κB信号通路在调节动脉粥样硬化的炎症反应中发挥重要的作用，其在多种刺激因子诱导后，通过调节凋亡抑制因子、白细胞介素相关基因的表达，不仅参与机体免疫调节、炎症反应及肿瘤等生理病理过程，还参与感染、细胞周期调控、细胞分化及凋亡等^[39]。与心脏血管功能相关的有5条，包括HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、细胞因子受体相互作用信号通路（Cytokine-cytokine receptor interaction signaling pathway）、VEGF信号通路（VEGF signaling pathway）、B细胞受体信号通路（B cell receptor signaling pathway）、cGMP-PKG信号通路（cGMP-PKG signaling pathway）。HIF-1是低氧状态下组织细胞产生的一种核蛋白，用于维持氧稳态的关键物质，当心肌缺血缺氧时，HIF-1α表达增加，促进血管新生，增加心肌血供，对保护心肌具有重要意义；VEGF可以促进血管内皮细胞分裂和增殖，诱导血管新生，增加血管通透性，促进侧支循环的建立，在缺血缺氧、炎症反应、外伤等生理病理过程扮演重要的角色^[40]；现有的研究结果证明，cGMP-PKG信号通路对于调控心血管系统的正常功能起着重要的作用，其在调节血压、抑制动脉粥样硬化和抗再狭窄、抗血管损伤、调节调节血管平滑肌细胞的收缩和舒张、抑制心肌细胞肥大等方面发挥重要作用^[41-42]。与氧化应激有关的信号通路有1条，包括过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路（PPAR signaling pathway）。与细胞增殖、凋亡、分化相关的信号通路有9条，包括MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、细胞凋亡（Apoptosis）、Ras信号通路（Ras signaling pathway）、FoxO信号通路（FoxO signaling pathway）、Neurotrophin信号通路（Neurotrophin signaling pathway）、ErbB信号通路（ErbB signaling pathway）、TGF-β信号通路（TGF-beta signaling pathway）、Jak-STAT信号通路（Jak-STAT signaling pathway）。MAPK是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者，MAPK信号通路对维持细胞正常生理功能，发挥着极其重要的作用^[43]，其主要包括p38MAPK、细胞外调节蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）3条，调节着细胞的增殖、分化、生长、凋亡以及炎症反应等多种重要的病理生理过程；PI3K- Akt信号通路具有广泛的生物学作用，参与调节细胞周期、能量代谢、物质合成等途径，是治疗冠心病、代谢紊乱等多种疾病的重要靶点^[44]。与糖脂代谢有关的信号通路有3条，包括胰岛素信号通路（Insulin signaling pathway）、cAMP信号通路（cAMP signaling pathway）、雌激素信号通路（Estrogen signaling pathway）。通过对信号通路分析发现，理气化痰活血方可能通过抗炎、抗氧化、抗心肌缺血、保护血管内皮、抑制细胞凋亡等过程治疗CSX。

综上所述，通过将网络数据库、药理学等多学科相结合，运用网络药理学从多角度探索了理气化痰活血方治疗CSX的可能作用机制，预测了理气化痰活血方治疗CSX的潜在靶点和信号通路，为其临床应用及进一步验证其药理作用机制提供理论基础。