骨质疏松症（OP）是一种常见的骨矿基代谢性疾病，表现为骨质含量减少、骨密度（BMD）下降、骨脆性增高和骨组织显微结构改变等，导致受轻微创伤即可引发骨折^[1-3]。OP已被世界卫生组织列为21世纪人类健康的4大疾病（心脑血管病、艾滋病、肿瘤、OP）之一^[4]，严重影响患者的生活质量和生命安全。有研究表明，2型糖尿病（T2DM）的高血糖状态对成骨细胞有着直接的细胞毒性作用，可抑制成骨细胞的功能^[5]。同时，T2DM在骨折愈合过程中会促进肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的过度表达，从而抑制骨髓间充质干细胞的增殖^[6]。此外，T2DM还会促进骨痂内软骨细胞的吸收，导致骨痂面积的减小^[7]。桃红四物汤取自《医垒元戎》，由当归、熟地黄、川芎、白芍、桃仁、红花6味中药组成，具有活血行气、化瘀止痛之功效^[8]，现代药理学研究表明，其具有扩张血管、抗炎、抗氧化、抗过敏、降血脂、调节免疫等作用，目前临床广泛用于脑梗死、糖尿病末梢神经炎、软组织损伤、人工关节置换术后等^[9]。本研究旨在探究桃红四物汤联合二甲双胍对T2DM合并OP大鼠骨折愈合的影响。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物

选取SPF级雌性SD大鼠40只，由本院医学动物实验中心提供，许可证号为SCXK（新）2019-0723，体质量（200±20）g，于本院动物实验中心常规饲养，室温维持（24±2）℃，湿度40%~65%，自然通风，自由摄食饮水。

1.1.2 药物

桃红四物汤由当归、熟地黄、川芎、白芍、桃仁、红花6味中药构成，以上中药材均购自新疆九州通医药有限公司，经检验符合2015年版《中华人民共和国药典》质量标准。取当归15 g，熟地黄15 g，川芎15 g，白芍15 g，桃仁9 g，红花6 g，加水煎煮回流提取约1 h，过滤，将滤液置于水浴浓缩，至相当于生药含量为1 g/mL。

盐酸二甲双胍片购自中美上海施贵宝制药有限公司，批准文号：国药准字H20023371，规格850 mg/片，批号：ABA4624。

1.1.3 试剂及仪器

10%水合氯醛：购自青岛宇龙海藻有限公司，批准文号：国药准字H37022673；离心机：购自美国Sigma公司，型号3KI8；全自动酶联免疫分析仪：购自美国BioTek公司，试剂盒购自美国BioTSZ公司；全自动生化分析仪：购自美国BeckmanCoulter公司，试剂盒购自美国BioTSZ公司；显微电子计算机断层扫描（microCT）：购自瑞士Scanco公司，型号CT40；双能X线骨密度扫描仪：购自美国Hologic公司，型号HOLOGIC4500A；力学实验仪：购自日本岛津公司，型号AG-1C。

1.2 实验方法 1.2.1 动物分组

将40只SD大鼠完全随机分为正常组、模型组、桃红四物汤组和联合组（n=10），其中模型组、桃红四物汤组和联合组按以下方法建立T2DM合并OP模型。

1.2.2 T2DM模型的建立

正常组以普通饲料喂养，模型组、桃红四物汤组和联合组大鼠均给予高糖高脂饲料喂养3周。于实验开始第1天时，禁食12 h，腹腔注射35 mg/kg的链脲佐菌素柠檬酸钠缓冲液。第7天时，禁食12 h，检测大鼠空腹血糖（FBG），若FBG≥13.9 mmol/L提示造模成功^[10]，剔除造模失败大鼠。每周定时测量大鼠尾静脉血糖值并记录。

1.2.3 OP模型的建立

第7天时，取T2DM造模成功的大鼠腹腔注射300 mg/kg的10%水合氯醛溶液麻醉，检测各只大鼠右侧股骨中段的BMD数值。背部术区备皮，碘伏消毒，取脊椎旁1 cm、髂骨嵴上2 cm为手术切口，切开约1 cm纵向切口，暴露双侧卵巢及输卵管，切除双侧卵巢，将周围软组织纳还，生理盐水反复冲洗切口，逐层关闭并缝合切口。术后肌内注射青霉素80万单位，每日2次，连续注射3 d。术后第28天，腹腔注射300 mg/kg的10%水合氯醛麻醉后，再次检查各只大鼠右侧股骨中段BMD值，并与造模前相比，若差异具有统计学意义（P＜0.05），则提示造模成功，剔除造模失败大鼠。

1.2.4 骨折大鼠模型的建立

第28天时，4组大鼠均腹腔注射300 mg/kg的10%水合氯醛麻醉，于右侧股骨中段切开皮肤和皮下组织，分离肌层后暴露股骨，线锯于股骨中段，横行锯断股骨。将直径1.5 mm的克氏针经髓腔固定骨折断端，逐层关闭并缝合。大鼠仰卧位置于骨折造模支架下，右后肢股骨以外展内旋位固定在骨折造模支架的凹槽上，骨刀轻压股骨中段，提起砝码至25~30 cm处，使其自由落体撞击下方螺母，螺母将力传导至骨刀，造成股骨中段骨折，手法触诊判断大鼠股骨是否骨折。手术完成后，在麻醉状态下立即拍摄患肢的正位X线片，确认骨折类型、移位程度、骨折断端对位对线情况、内固定是否牢靠、有无变形、断裂、松动等异常，筛除不符合实验要求的动物。要求骨折类型为横行骨折或短斜行骨折，并且无明显移位视为造模成功。术后肌内注射青霉素80万单位，每日2次，连续注射3 d。

1.2.5 治疗方法

桃红四物汤组和联合组参考实验大鼠和人的用药剂量换算方法^[11]及文献报道^[12]的剂量，于第7天开始每天以6 g/kg的剂量灌胃桃红四物汤药液；联合组在此基础上灌胃100 mg/kg的二甲双胍生理盐水混悬液；正常组和模型组于第7天开始按照大鼠的体质量，每日灌胃10 mL/kg生理盐水。每周定时称量4组大鼠的体质量，并根据其变化调节药物用量。治疗6周后，即第71天时，处死各组大鼠，取样并检测相关指标。

1.3 观察指标 1.3.1 X线检查

治疗结束后，4组大鼠均腹腔注射300 mg/kg的10%水合氯醛麻醉，采用DR 7500系统对各组大鼠行X线检查。

1.3.2 BMD

采用双能X线全身骨密度测量仪检测股骨BMD值。

1.3.3 苏木精-伊红（HE）染色

治疗结束后处死各组大鼠，取股骨，置于乙二胺四乙酸（EDTA，pH值为7.20）溶液中脱钙，行常规包埋、切片、脱蜡，HE染色，光学显微镜下观察骨痂微结构。

1.3.4 骨痂相关指标检查

以microCT扫描股骨标本，并利用自带软件获取相对骨体积（BV）、骨小梁数（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分离度（TB.Sp）、连接密度（Conn.D）、骨体积分数（BV/TV）和骨表面积体积比（BS/BV）等参数。

1.3.5 生物力学性能

处死各组大鼠后，取右侧股骨制作标本，用湿纱布包裹，采用力学实验仪进行4点弯曲实验。顶端跨距8 mm，底端跨距20 mm，加载速度为1 mm/min，测量期间保持各标本位置一致。通过载荷-位移曲线获得最大载荷，以右侧股骨最大载荷与左侧非骨折侧股骨最大载荷的比值表示骨折载荷恢复率（%）。

1.3.6 FBG

于实验第7天开始，每周固定时间取大鼠尾静脉血检测FBG值，记录其变化趋势。

1.3.7 血管内皮生长因子（VEGF）、纤维蛋白原（FIB）、碱性磷酸酶（ALP）和D-二聚体的表达水平

采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测各组大鼠血清中VEGF和FIB的表达水平，采用速率法检测血清中ALP和D-二聚体的表达水平，以上操作均严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 实验动物情况

实验期间共有2只大鼠死亡，其中正常组1只、模型组1只；T2DM模型建立后共有2只大鼠血糖指标未达标，其中二甲双胍组1只、联合组1只；OP模型均建立成功。最终各组大鼠数量为：正常组9只，模型组9只，二甲双胍组9只，联合组9只。

2.2 X线检查

正常组大鼠骨折线已几乎不见，骨折端出现较高密度的骨痂，愈合良好；模型组大鼠骨折线仍清晰可见，且骨折端未见骨痂；桃红四物汤组和联合组与模型组相比，骨折线不清晰，且可见骨性骨痂连接于骨折端。见图 1。

2.3 各组大鼠BMD比较

治疗后模型组大鼠BMD低于正常组（P＜0.05）；与模型组相比，桃红四物汤组和联合组的BMD值提高（P＜0.05）；与桃红四物汤组相比，联合组的BMD值较高（P＜0.05）。见表 1。

2.4 HE染色

正常组大鼠骨折端的骨性骨痂已基本恢复成板骨，可见少量软骨分布于外骨痂中；模型组可见较多软骨和纤维组织，而骨性骨痂较少；桃红四物汤组和联合组与模型组相比，骨性骨痂明显增多，且软骨和纤维组织较少，可见编织骨和板层骨开始融合。见图 2。

2.5 骨痂相关指标分析

模型组大鼠的Tb.N、Tb.Th、Conn.D和BV/TV均低于正常组，而Tb.Sp和BS/BV均高于正常组（P＜0.05）；桃红四物汤组和联合组的Tb.N、Tb.Th、Conn.D和BV/TV均高于模型组（P＜0.05），Tb.Sp和BS/BV低于模型组（P＜0.05）；与桃红四物汤组相比，联合组Tb.N、Tb.Th、Conn.D和BV/TV均较高，BS/BV较低（P＜0.05）。见表 2。

2.6 生物力学性质

根据载荷-位移曲线获得最大载荷（N），最大载荷恢复率（%）以骨折侧股骨最大载荷与非骨折侧股骨最大载荷的比值来表示，结果显示，模型组最大载荷和最大载荷恢复率低于正常组（P＜0.05）；桃红四物汤组与联合组的最大载荷及最大载荷恢复率均高于模型组（P＜0.05）；与桃红四物汤组相比，联合组最大载荷和最大载荷恢复率较高（P＜0.05）。见表 3。

2.7 各组大鼠FBG变化

建立T2DM模型后，与正常组相比，模型组大鼠FBG升高；桃红四物汤组和联合组大鼠FBG经治疗后平稳下降并接近正常组水平。见图 3。

2.8 血清VEGF、FIB、ALP和D-二聚体表达水平比较

与正常组相比，模型组血清VEGF、FIB、ALP和D-二聚体的表达水平提高（P＜0.05）；与模型组相比，桃红四物汤组和联合组VEGF、FIB、ALP和D-二聚体的表达水平降低（P＜0.05）；与桃红四物汤组相比，联合组VEGF、FIB和D-二聚体的表达水平较低，ALP增加（P＜0.05）。见图 4。

3 讨论

OP的发病机制非常复杂，诸如骨质量、几何结构、骨转换率等可遗传基因以及维生素D受体（VDR）、Ⅰ型胶原蛋白、雌激素受体、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等细胞因子均可能影响骨代谢，从而对OP的发生发展起重要影响作用^[13-15]。骨折是OP最常见的并发症，当成骨细胞的成骨功能和破骨细胞的骨吸收功能失衡，便会引起骨量减少、结构退化、骨脆性增加，一旦载荷超过自身的支持强度即可引起骨折，大大增加了患者的致残率和致死率^[16]。糖尿病患者体内的高血糖状态会导致机体蓄积大量糖基化终末产物，其不仅能通过与胶原蛋白发生交联反应，进而影响骨的质量，还可直接抑制成骨细胞的增殖和分化，并诱导成骨细胞凋亡，从而加重OP的程度。

桃红四物汤由当归、熟地黄、川芎、白芍、桃仁、红花6味中药组成，当归补血活血，川芎理气行血，熟地黄补血滋阴，白芍养血柔肝，缓急止痛，加入桃仁和红花，增加了活血祛瘀功效^[17]。现代药理学研究表明，当归可促进造血干细胞增殖和分化，改善骨折部位微循环和血供情况；川芎可增强巨噬细胞的功能，进而调节免疫功能，有助于修复软组织损伤；白芍具有抗炎、调节免疫、增强造血功能等作用，同样有助于改善局部血液流变学状态、加快毛细血管增生等，从而改善骨代谢状况^[18]。唐偲等^[19]和李盼祥等^[20]诸多学者均报道桃红四物汤可改善OP骨折患者的炎症因子表达、骨代谢状况和血液流变学状态，缓解骨折部位的肿胀和疼痛，促进骨折愈合和骨功能恢复。然而，关于桃红四物汤用于T2DM合并OP骨折治疗的研究鲜有报道，因此本研究旨在探究桃红四物汤对T2DM合并OP大鼠骨折愈合的影响。

OP为骨矿基代谢异常性疾病，可导致骨质含量减少、BMD下降、骨小梁稀松、骨脆性增高、骨机械强度下降等，因此BMD为诊断和预测OP最好的单一指标^[21]。同时，OP骨折在愈合过程中成骨速度减慢，矿物质沉积速度减慢，皮质骨厚度变薄，从而导致骨痂形成量减少、软骨组织和微结构受损、生物力学性能下降，极易再次发生骨折。骨的微观结构和骨的脆性密切相关，骨小梁厚度和数量在发生OP时数值均降低，从而导致骨最大载荷量降低，因此骨小梁的丢失会导致骨折风险增高。骨量的减少可导致骨骼结构的破坏，如皮质骨变薄、骨内穿孔、骨小梁变细、骨小梁数量减少、骨小梁断裂和消失等，骨生物力学指标可从各方面反映骨骼的物理特征和结构变化，从而定量反映OP发生程度^[22]。在本研究中，X线检查和骨组织HE染色结果可见，桃红四物汤组和联合组大鼠骨折端愈合情况优于模型组。与此同时，桃红四物汤组和联合组大鼠治疗后BMD值提高，骨痂相关指标及生物力学性能均得到改善，提示二甲双胍和桃红四物汤可显著提高OP大鼠BMD值，改善生物力学性能和骨痂形成，促进T2DM合并OP大鼠骨折愈合。

流行病学研究发现，T2DM患者骨折的发生率显著升高^[23]。基础研究表明，高血糖环境可减缓骨折的愈合，损伤骨痂的骨量和微结构，而对血糖水平的干预可改善BMD和骨痂微结构，促进骨折的愈合，其机制可能与长期高血糖水平对成骨细胞的毒性损伤，以及高血糖诱导的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子的高表达而抑制骨髓间充质干细胞的增殖有关^[24-25]。本研究通过连续监测各组大鼠FBG变化趋势，发现二甲双胍组和联合组大鼠FBG平稳下降并接近正常组水平，结合上述BMD值、骨痂相关指标及生物力学性能的结果可以看出，联合组的BMD、骨痂相关指标和生物力学性能均优于桃红四物汤组，提示血糖水平可能干预了骨折的修复和愈合过程，因此，对血糖水平的调控可能会有效改善OP程度并促进骨折愈合。

目前多数学者均研究认为骨折愈合是一个涉及多种细胞因子和生长因子的复杂过程，包括VEGF、FIB、血小板衍生生长因子（PDGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、ALP和D-二聚体等在内的血清因子均影响骨折的愈合。VEGF是一种高特异性的促血管内皮细胞生长因子，可直接或间接影响血管再生的各个环节，具有促进血管内皮细胞迁移和增殖、增加血管通透性、促进新生血管形成等作用^[26]，可为局部骨再生及代谢提供有利的微环境。既往研究表明，VEGF还可作用于成骨细胞，诱导其迁移和分化，促进骨形成和骨重建。FIB是一种凝血相关蛋白，其表达水平直接影响血液黏度，骨折创伤通常会伴有不同程度的软组织损伤及出血，血管内皮细胞损伤激活机体凝血系统，可导致FIB表达水平的提高^[27]。吴龙昌等^[28]报道在骨折创伤的刺激下，软组织、血管等受到损伤，FIB水平会反应性增高。ALP是由骨细胞分泌的一种促基质钙化的糖蛋白，是一种骨形成的标志物，能反映骨细胞活性的变化情况。另有基础研究表明，ALP可能参与了Notch信号通路的调控，与核转录因子-κB受体活化因子配体（RANKL）及骨保护素（OPG）的表达密切相关，参与破骨细胞的分化、成熟和形成，从而最终影响骨重建及骨强度^[29]。D-二聚体为纤维蛋白降解产物，可反映骨折愈合的情况。温慧敏等^[30]研究显示，骨折模型大鼠的血清D-二聚体表达水平显著升高。国外学者研究显示，通过对VEGF等细胞因子的调控，一方面可发挥其血管内皮活性而促进骨形成和骨重建，另一方面还可上调骨痂内Ⅱ型胶原蛋白的表达，从而促进骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞，提高软细胞活性，有益于骨折愈合^[31]。本研究中，桃红四物汤组和联合组大鼠治疗后血清VEGF、FIB、ALP、D-二聚体的表达水平较模型组均降低，提示二甲双胍联合桃红四物汤可通过调节血清VEGF、FIB、ALP、D-二聚体的表达而促进骨折愈合。范联鲲等^[32]报道桃红四物汤可提高骨折修复细胞因子如VEGF、骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、转化生长因子-β1（TGF-β1）的表达水平，促进骨折处血管新生，为骨修复提供良好的环境。

综上，桃红四物汤联合二甲双胍可降低血糖水平，提高OP大鼠的BMD和生物力学性能，改善骨痂的形成，从而有效促进T2DM合并OP大鼠骨折的愈合。其机制可能与以下两个方面有关：1）二甲双胍调控血糖水平，从而避免了高血糖环境对成骨细胞的毒性作用，减少了对骨痂内软骨组织和结构的损伤，从而有利于骨折处的恢复。2）桃红四物汤活血化瘀，改善局部血供和氧供，降低相关细胞因子的表达水平，加速骨细胞分化，促进成骨细胞和破骨细胞的修复功能，并促进血管新生，改善局部微循环，从而加速骨折部位的修复和愈合。