2021, Vol. 40文章信息
- 秦欢, 张兵, 马喆, 张瀛, 张钰坤, 刘志东
- QIN Huan, ZHANG Bing, MA Zhe, ZHANG Ying, ZHANG Yukun, LIU Zhidong
- PEG修饰的紫草素纳米结构脂质载体的制备和体外评价
- Preparation and in vitro evaluation of PEG-modified shikonin nanostructured lipid carrier
- 天津中医药大学学报, 2021, 40(5): 647-652
- Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2021, 40(5): 647-652
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2021.05.23
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文章历史
收稿日期: 2021-06-02
2. 天津中医药大学现代中药发现与制剂技术教育部工程研究中心, 天津 301617;
3. 徐州工程学院食品与生物工程学院, 徐州 221008
2. Engineering Research Center of Modern Chinese Medicine Discovery and Preparation Technique, Ministry of Education, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China;
3. College of Food and Biological Engineering, Xuzhou University of Technology, Xuzhou 221008, China
乳腺癌已成为全球女性发病率最高的恶性肿瘤，严重影响了女性的身心健康[1-3]。临床治疗以手术为主，辅助以放化疗、内分泌治疗、靶向治疗等手段[4]。紫草素（SKN）及其衍生物有抗炎[5]、抗病毒[6]、抗免疫[7]等多种功效，通过降低PI3K、Akt的表达及其磷酸化水平[8-9]，抑制细胞活力，上调乳腺癌MCF-7细胞中凋亡相关蛋白半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-3和Caspase-9的表达，破坏细胞的凋亡调节平衡，促进MCF-7细胞发生自噬[10-12]，影响肿瘤血管异常增生等多种途径来共同发挥抗肿瘤作用[13]。由于SKN不溶于水，体内吸收存在巨大阻碍，限制了其进一步的开发利用。因此通过制剂学手段提高靶细胞/部位的药物摄取及聚集尤为重要。纳米结构脂质载体（NLC）因膜材中加入了不相容的液体脂质，使纳米粒可以以结晶缺陷型或无定型结构存在[14]，增加了药物的包封率和载药率，存储更加稳定，可实现多途径给药，解决了难溶性药物的给药困境[15]。本研究依据NLC优势，制备了紫草素纳米脂质载体（SKN-NLC），能够显著提高SKN的溶解度，通过聚乙二醇（PEG）修饰来延长药物在体内的循环时间，从而提高SKN的生物利用度，更好地发挥抗肿瘤效果。SKN化学结构式见图 1。
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| 图 1 SKN化学结构式 |
岛津LC 20AT型高效液相色谱仪（岛津公司，日本）；RET BS 25型磁力搅拌器（艾卡公司，德国）；X射线衍射仪（布鲁克公司，德国）；SorvallST 16R型台式通用冷冻离心机（赛默飞世尔科技公司，美国）；Nano ZS型激光散射粒径分析仪（马尔文公司，英国）；TECNAI 10透射电子显微镜（飞利浦公司，荷兰）；DSC-204差示扫描量热仪（耐驰公司，德国）；FORMA 3111 CO2恒温培养箱（赛默飞世尔科技公司，美国）；生物安全柜（赛默飞世尔科技公司，美国）；Spark型多功能酶标仪（帝肯公司，瑞士）；GE In Cell Analyzer 2000高内涵细胞成像分析系统（通用电气医疗系统有限公司，中国）；KQ-400KDE型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，中国）；FA 124型万分之一天平（天津亿诺科学技术有限公司，中国）；XP205电子天平（梅特勒托利多公司，瑞士）；Milli-Q超纯水系统（默克密理博公司，美国）。
1.2 药品与试剂SKN对照品（成都普斯生物科技股份有限公司，批号：82854-37-3，含量 > 98%）；人乳腺癌细胞MCF-7细胞（中国科学院细胞库）；0.25%胰酶+0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）（赛默飞世尔科技公司，批号：25200-056）；双抗（10 000 U青霉素+10 000 μg链霉素，赛默飞世尔科技公司，批号：15140-122）；DMEM基础培养基（赛默飞世尔科技公司，批号：2044490）；胎牛血清（上海逍鹏生物，批号：04-001-1ACS）；香豆素-6（伊诺凯科技有限公司，批号：S2137139，含量 > 98%）；Hoechst33342（赫希斯特公司，批号：B8040）；CCK-8试剂盒（同仁化学研究所）；黑色96孔板（德国葛来娜公司，批号：655090）；96孔板（无锡耐思生物科技股份有限公司，批号：701001-1）；细胞培养瓶（无锡耐思生物科技股份有限公司，批号：707003）；辛酸癸酸三酰甘油（Miglyol812，北京凤礼精求商贸有限责任公司）；大豆磷脂（上海艾伟拓医药科技有限公司，批号：SY-SI-180101）；聚氧乙烯硬脂酸酯（西格玛公司，批号：MKBV6365V）；山嵛酸甘油酯（嘉法狮公司，批号：108833）；三氯甲烷（CHCl3，天津康科德科技有限公司，分析纯，批号：20181101）；无水乙醇（天津市康科德科技有限公司，色谱纯）；超滤离心管（规格50 kDa，默克密理博公司）；乙腈（赛默飞世尔科技公司，色谱纯）；甲酸（化成工业株式会社，分析纯）；甲醇（赛默飞世尔科技公司，色谱纯）；二甲基亚砜（DMSO，西格玛公司，批号：D2650）；0.22 μm注射器式微孔滤膜（Millex-GP，默克密理博公司）；去离子水（自制）。
2 方法与结果 2.1 SKN-NLC的制备采用乳化-固化法制备NLC，将处方量的山嵛酸甘油酯、液体脂质辛酸/癸酸三甘油酯溶于CHCl3中，卵磷脂溶于无水乙醇中，在74~75 ℃水浴中混合均匀构成油相；将处方量的聚氧乙烯硬脂酸酯溶于去离子水中构成水相，将油相注入水相中，磁力搅拌均匀至澄清，过0.22 μm有机滤膜后置于4 ℃条件下冷藏固化，即得NLC。同法可制得SKN-NLC和SKN-PEG-NLC。
2.2 含量测定方法 2.2.1 色谱条件色谱柱：Agilent ZorbaxSB-C18（安捷伦公司，美国，4.6 mm×50 mm，5 μm，批号：B11055，S.N.USFA003181）；流动相：乙腈-0.2%甲酸水（75∶25）；检测波长：516 nm；流速：1 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。
2.2.2 对照品溶液的制备精密称定SKN对照品4.90 mg，加甲醇定容至10 mL，得到浓度为0.49 mg/mL的对照品储备液。
2.2.3 标准曲线的制备取对照品储备液，分别稀释出245.00、122.50、61.25、30.63、15.31、7.66 μg/mL的溶液，每次进样10 μL，以浓度为横坐标，峰响应值为纵坐标，绘制标准曲线。得到线性回归方程为：Y=10 523X-8 748.9，r2=0.999 9（n=3），结果表明SKN在7.66~245.00 μg/mL范围内线性关系良好。
2.2.4 专属性考察分别取SKN对照品溶液、乙腈破乳后的Blank-NLC溶液、SKN-NLC溶液、SKN-PEG-NLC溶液，每次进样10 μL，记录色谱图。如图 2所示，辅料和溶剂对药物测定没有干扰，表明该方法专属性良好。
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| 注：A. Blank-NLC；B.乙腈；C. SKN-PEG-NLC；D. SKN-NLC；E. SKN。 图 2 SKN专属性考察结果 |
取“2.2.2”项中的对照品储备液，分别以甲醇稀释配制成低（30.63 μg/mL）、中（61.25 μg/mL）、高（122.50 μg/mL）3个浓度的溶液，按照“2.2.1”项下的色谱条件，1 d内重复进样3次，计算日内精密度（n=3）。连续测定3 d，计算日间精密度。计算得日内RSD分别为0.48%、0.63%、0.90%；日间RSD分别为1.24%、0.76%、1.08%，表明日内、日间精密度较好。
2.2.6 稳定性实验精密量取SKN-NLC，在0、12、24 h时分别吸取10 μL进样，按照“2.2.1”项下的色谱条件，测定峰面积，计算峰面积的RSD（n=6）。结果RSD为2.63%，表明样品在24 h内稳定性良好。
2.2.7 重复性实验平行制备6份破乳的SKN-NLC样品，按“2.2.1”项下色谱条件测定，测得SKN的平均含量为28.53 μg/mL，RSD为1.03%（n=6），表明方法重复性良好。
2.2.8 包封率的测定按“2.1”项下方法制备SKN-NLC样品溶液，取0.3 mL样品加去离子水稀释至3 mL，取2 mL稀释后的溶液置于50 KDa超滤离心管内管中，5 000 r/min，离心半径9 cm，离心20 min，取外管中液体，按照“2.2.1”项下的色谱条件进行SKN含量测定，游离SKN含量记为W游离。从上述SKN-NLC样品溶液中取0.2 mL，加入1.8 mL乙腈超声破乳，5 000 r/min，离心半径9 cm，离心20 min。按照“2.2.1”项下的色谱条件进行SKN含量测定，处方中SKN总含量记为W总。按照下列公式计算包封率，包封率（%）=[（W总-W游离）÷W总]×100%。其中W游离为超滤离心管外管中药物量，W总为加入药物和脂质材料总量。测得SKN-NLC和SKN-PEG-NLC的包封率分别为95%和98%。
2.3 NLC的理化表征 2.3.1 粒径电位测定取制备的SKN-NLC和SKN-PEG-NLC适量，用去离子水稀释至适宜浓度，室温下用激光粒径测定仪分别测定样品的粒径和Zeta电位。测定3次，取平均值。结果显示，SKN-NLC粒径为（17.69±2.32）nm，多分散指数（PDI）为（0.61±1.41）；Zeta电位为[-（8.81±1.39）] mV。SKN-PEG-NLC粒径为（19.68±1.25）nm，PDI为（0.28±0.68）；Zeta电位为[-（20.27±1.27）] mV。见开放科学（资源服务）标识码（OSID）。
2.3.2 制剂形态观察取Blank-NLC、SKN-NLC、SKN-PEG-NLC溶液稀释至适宜浓度，滴加在覆盖铜网的碳膜上，使液滴在铜网上呈半球形液面，待自然干燥后，滴入2%磷钨酸溶液染色制片，复染3 min，用滤纸沿铜网周围吸干染液，自然干燥后置于透射电子显微镜（TEM）下观察NLC形态并拍照。
各组制剂外观形态见OSID，较为澄清透明，质地均一，空白制剂有淡蓝色乳光。由图 3可知，透射电镜下制剂溶液呈圆形小球状，分散均匀，形状规整，大小在20 nm左右。与纳米激光粒径仪测定的结果相吻合。
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| 注：A. Blank-NLC；B. SKN-NLC；C. SKN-PEG-NLC。 图 3 NLC的透射电镜结果 |
精密称取SKN对照品、Blank-NLC冻干粉、SKN-NLC冻干粉、SKN-PEG-NLC冻干粉、物理混合物各5 mg，升温速率为10 ℃/min，扫描范围为30~300 ℃，氮气流速为30 mL/min，差示扫描量热曲线结果见图 4。
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| 图 4 NLC的差示扫描量热结果 |
结果显示，SKN和物理混合物在150 ℃下显示出SKN的放热特征峰。在200 ℃有1个明显吸热特征峰，而该峰在Blank-NLC、SKN-NLC和SKN-PEG-NLC中消失。Blank-NLC、SKN-NLC、SKN-PEG-NLC和物理混合物在50、180和225 ℃下显示出3个明显的放热峰，而SKN中并未出现，表明SKN以非晶体形态包裹于NLC中。
2.5 X射线衍射研究精密称取SKN对照品、Blank-NLC冻干粉、SKN-NLC冻干粉、SKN-PEG-NLC冻干粉和物理混合物约50 mg，选用Cu靶/石墨单色器，设定检测条件：电压40 kV，电流200 mA，扫描范围5°~80°，扫描速度5°/min，采样时间1 s，用X射线衍射仪进行测定，结果见图 5。
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| 注: A. SKN; B. Blank-NLC; C. 物理混合物; D. SKN-NLC; E. SKN-PEG-NLC。 图 5 NLC的X射线衍射结果 |
SKN和物理混合物在7.5°、10.0°、14.5°时表现出明显的SKN峰值，而在Blank-NLC、SKN-NLC和SKN-PEG-NLC中该峰值消失。Blank-NLC、SKN-NLC、SKN-PEG-NLC和物理混合物在20°~25°范围内显示出NLC的特征峰。结果表明SKN以分子分散形式而不是游离形式存在于NLC中，这与差示扫描量热测定的结果一致。
2.6 体外细胞摄取研究 2.6.1 细胞培养使用10%胎牛血清DMEM培养基，于37 ℃下外接5% CO2培养箱中培养MCF-7细胞，无菌培养与传代。
2.6.2 SKN的细胞毒性评价以每孔8 000个细胞的密度将MCF-7细胞接种于96孔板中，培养箱中培养至80%细胞密度后，分别使用浓度为0、1、2、4、5、8、10、15、30 μmol/L的SKN溶液处理，采用CCK-8法在450 nm下测定细胞活性，计算细胞存活率。得SKN半数抑制浓度（IC50）为11.05 μmol/L，且细胞的存活率随着SKN给药浓度的增大而降低，具有浓度依赖性。细胞存活率（%）=[（As-Ab）÷（Ac-Ab）]×100%（As为实验孔吸光度，Ab为空白孔吸光度，Ac为对照孔吸光度）。
2.6.3 载体抗肿瘤细胞增殖评价按“2.6.2”项实验步骤，分别加入100 μL浓度为4、11、15 μmol/L的SKN、SKN-NLC和SKN-PEG-NLC溶液，计算细胞存活率。采用SPSS 22.0进行统计分析，所有实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较时，若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett-t法，P＜0.05表示差异有统计学意义。
SKN在4 μmol/L时各组对MCF-7细胞均无明显毒性，与对照组比较无统计学差异（P＞0.05）。当浓度为11 μmol/L时，SKN-PEG-NLC溶液抗肿瘤效果与SKN溶液组及SKN-NLC溶液组比较，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.001）。当浓度为15 μmol/L时，SKN-PEG-NLC溶液抗肿瘤效果与SKN溶液组比较，差异有统计学意义（P＜0.001）。见图 6。
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| 注：与SKN溶液组比较，*P＜0.01，**P＜0.001；与SKN-NLC溶液组比较，#P＜0.01。 图 6 NLC的细胞毒性结果（x±s，n=6） |
按“2.6.2”项实验步骤培养MCF-7细胞，避光操作每孔加入1 μg/mL的Hoechst 33342溶液孵育30 min，用常温的磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗细胞2遍。加入稀释好的香豆素-6标记的各组制剂，共孵育4 h。将处理好的96孔板放入细胞高内涵成像仪中，设定染料的激发波长与发射波长进行测定。统计分析方法同“2.6.3”项。
荧光主要分布在细胞核周围，即SKN-NLC被MCF-7细胞摄取后主要存在于细胞质中。制剂组细胞荧光强度明显高于SKN溶液组，表明MCF-7细胞对SKN-NLC的摄取高于溶液组。此外，SKN-PEG-NLC溶液的荧光强度高于SKN-NLC溶液组，推测PEG修饰后可增加MCF-7细胞对SKN-NLC的摄取。综上，通过将SKN包载于NLC中，表面进行PEG修饰后可增加MCF-7细胞对制剂的摄取。见图 7。
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| 注：与SKN溶液组比较，*P＜0.05，**P＜0.001；与SKN-NLC溶液组比较，#P＜0.01。 图 7 高内涵荧光强度柱状图（A）和高内涵荧光强度（B）细胞摄取结果（x±s，n=6） |
本研究通过乳化蒸发-低温固化法制备了SKN-NLC，通过透射电镜和马尔文激光粒径分析仪可知，制剂外观圆整，粒径分布均匀，体系稳定。粒径分布和电位是纳米载体质量评价的一个非常重要的指标[16]，本研究以实验室前期考察得到的最佳处方制备出的SKN-NLC粒径为17.69 nm，SKN-PEG-NLC粒径为19.68 nm。相较于SKN-NLC，SKN-PEG-NLC的PDI更小，体系更均一，包封率更高。这种空间稳定材料有望制备出更为理想的SKN-NLC制剂，为体内外SKN递送提供稳定保障[17]。本研究通过差示扫描量热仪对SKN、Blank-NLC、SKN-NLC、SKN-PEG-NLC及物理混合物的吸热峰进行表征研究和比较分析，证明了SKN在NLC中以无定形形式存在，X射线衍射实验也证明了上述结论。由细胞增殖抑制实验可知SKN-PEG-NLC的肿瘤抑制作用大于SKN-NLC和SKN溶液。本研究中选择脂溶性的香豆素-6作为荧光探针来替代SKN制备荧光标记的NLC，通过考察发现香豆素-6浓度为0.05 μg/mL，Hoechst浓度为1 μg/mL时对MCF-7细胞无毒性作用，可以进行后续的细胞摄取实验。本实验综合以上研究结果，通过制备NLC提高了SKN的生物利用度，并初步证明了PEG化的SKN-NLC在体外抑制乳腺癌的优势作用，但SKN进入细胞后的抑瘤机制等仍需进一步研究。
| [1] |
SANG M M, LIU F L, WANG Y, et al. A novel redox/pH dual-responsive and hyaluronic acid-decorated multifunctional magnetic complex micelle for targeted gambogic acid delivery for the treatment of triple negative breast cancer[J]. Drug Delivery, 2018, 25(1): 1846-1857. DOI:10.1080/10717544.2018.1486472 |
| [2] |
XIAO W, ZHENG S, YANG A, et al. Incidence and survival outcomes of breast cancer with synchronous hepatic metastases: a population-based study[J]. Journal of Cancer, 2018, 9(23): 4306-4313. DOI:10.7150/jca.29190 |
| [3] |
KIM H J, WANG K E, PARK D S, et al. Shikonin-induced necroptosis is enhanced by the inhibition of autophagy innon-small cell lung cancer cells[J]. Journal of Translational Medicine, 2017, 15(1): 123. DOI:10.1186/s12967-017-1223-7 |
| [4] |
BI Y, ZHU Y, ZHANG M, et al. Effect of shikonin on spinal cord injury in rats via regulation of HMGB1/TLR4/NF-kBsignaling pathway[J]. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology, 2017, 43(2): 481-491. DOI:10.1159/000480474 |
| [5] |
柴冰阳, 陈泽慧, 张闪闪, 等. 4种细胞毒活性方法评价紫草素体外肿瘤细胞抑制作用效果[J]. 中草药, 2019, 50(1): 172-177. CHAI B Y, CHEN Z H, ZHANG S S, et al. Evaluation effects of four cytotoxicity methods on in vitro inhibition of shikonin against tumor cells[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2019, 50(1): 172-177. |
| [6] |
LU B, GONG X, WANG Z Q, et al. Shikonin induces glioma cell necroptosis in vitro by ROS overproduction and promoting RIP1/RIP3 necrosome formation[J]. Acta Pharmacologica Sinica, 2017, 38(11): 1543-1553. DOI:10.1038/aps.2017.112 |
| [7] |
ZHAO X Y, ZHU Y N, HU J H, et al. Shikonin inhibits tumor growth in mice by suppressing pyruvate kinase M2-mediated aerobic glycolysis[J]. Scientific Reports, 2018, 8(1): 14517. DOI:10.1038/s41598-018-31615-y |
| [8] |
TONG Y, BAI L, GONG R, et al. Shikonin protects PC12 cells againstbeta-amyloid peptide-induced cell injury through antioxidant and antiapoptotic activities[J]. Scientific Reports, 2018, 8(1): 26. DOI:10.1038/s41598-017-18058-7 |
| [9] |
CHEN Y, CHEN Z Y, CHEN L, et al. Shikonin inhibits triple-negative breast cancer-cell metastasis by reversing the epithelial-to-mesenchymal transition via glycogen synthase kinase 3β-regulated suppression of β-catenin signaling[J]. Biochemical Pharmacology, 2019, 16(6): 33-45. |
| [10] |
YANG Y, GAO W Y, TAO S Y, et al. ER-mediated anti-tumor effects of shikonin on breast cancer[J]. European Journal of Pharmacology, 2019, 86(3): 172667. |
| [11] |
安兴晨, 董天睿, 王晶, 等. 紫草素诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡及其机制探讨[J]. 中国医刊, 2019, 54(11): 1223-1226. AN X C, DONG T R, WANG J, et al. Shikonin induce the apoptosisof breast cancer MCF-7 cells and its mechanism[J]. Chinese Medicine, 2019, 54(11): 1223-1226. DOI:10.3969/j.issn.1008-1070.2019.11.019 |
| [12] |
XU J, KOIZUMI K, LIU M, et al. Shikonin inducesan anti-tumor effect on murine mammary cancer via p38-dependent apoptosis[J]. Oncology Reports, 2019, 41(3): 2020-2026. |
| [13] |
黄瑞, 郭盼, 刘勃缨, 等. 藤黄酸纳米结构脂质载体的制备及抗肿瘤作用初步评价[J]. 天津中医药, 2017, 34(1): 62-65. HUANG R, GUO P, LIU B Y, et al. The preparation and preliminary evaluation of anti-tumor effect of Gambogic acid nanostructure lipid carrier[J]. Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2017, 34(1): 62-65. |
| [14] |
王洁, 李倩, 吴静华, 等. CD133抗体修饰的紫草素微乳的制备及抗三阴性乳腺癌研究[J]. 中草药, 2019, 50(7): 1587-1595. WANG J, LI Q, WU J H, et al. Treatment of triple-negative breast cancer with anti CD133 antibody-modified shikonin-loaded microemulsion[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2019, 50(7): 1587-1595. |
| [15] |
史凡, 杨红. 紫草素纳米结构脂质载体制备与质量评价研究[J]. 实验技术与管理, 2019, 36(1): 96-99, 109. SHI F, YANG H. Research on preparation and quality evaluation of shikonin nanostructured lipid carrier[J]. Experimental Technology and Management, 2019, 36(1): 96-99, 109. |
| [16] |
陈阳, 陈志坚, 高赟, 等. 紫草素及其衍生物抗肿瘤作用研究进展[J]. 中草药, 2019, 50(14): 3503-3509. CHEN Y, CHEN Z J, GAO Y, et al. Research progress on anti-tumor activity of shikonin and its derivatives[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2019, 50(14): 3503-3509. |
| [17] |
刘静静, 李新悦, 吴玉梅, 等. 叶酸修饰载丹参酮ⅡA纳米结构脂质载体的制备及其理化表征[J]. 天津中医药大学学报, 2020, 39(1): 98-102. LIU J J, LI X Y, WU Y M, et al. Preparation and physicochemical characterization of folic acid modified nanostructured lipid carrier loaded with tanshinone ⅡA[J]. Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2020, 39(1): 98-102. |