细辛为马兜铃科植物北细辛Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var. mands huricum（Maxim.）Kitag.、汉城细辛Asarum sieboldii Miq. var. seoulense Nakai或华细辛Asarum sieboldii Miq.的干燥根和根茎。前两种习称“辽细辛”^[1]。细辛气辛香、味温，入肺、肾、心经。细辛在中医药学上具有祛风散寒、止痛、通窍、温肺化饮等功效，临床上常用于治疗风寒头痛、鼻塞、牙痛、痰饮咳喘、关节痛等疾病^[2]。近些年来对细辛的挥发性成分研究较多^[3]，但对于细辛水提物的研究相对较少^[4]。Huang等^[5]指出具有特异性的“马兜铃酸突变指纹”会被含有马兜铃酸的中药诱导从而诱发肝癌。细辛为马兜铃科植物，其非挥发性成分中含有马兜铃酸^[6-7]。同时，中药材在临床上主要采用水煎煮的提取方法，在古代临床上早有“细辛不过钱”的说法^[8]。从中药材细辛临床安全用药的角度考虑，需要建立一种高效、快速的分析检测方法完善对细辛药材水提物的质量评价。

1 材料 1.1 仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪（Agilent，USA）；Milli-Q IQ 7005超纯水制备仪（Millipore公司）；5424R型高速离心机（德国Eppendorf公司）；AS 60/220.R2型十万分之一天平（波兰RADWAG公司）；G3KT18273型旋涡混合器（赛默飞世尔科技公司）。

1.2 试药

对照品细辛脂素（批号：DST180425-014）、马兜铃酸A（批号：DST180413-021）、芝麻脂素（批号：MUST-1706301）、卡枯醇（批号：DST190325-028）、去甲乌药碱（批号：DST190402-154）、槲皮素（批号：DST180521-028）购于成都德思特生物科技有限公司；甲醇为色谱纯，购于美国Fisher公司；甲酸为色谱纯，购于美国ROE公司；超纯水由Milli-Q超纯水仪制备。

1.3 样品来源

10批细辛药材分别来源于辽宁盘锦，辽宁丹东，辽宁本溪，辽宁沈阳，吉林白山，山西长治，云南本溪，辽宁锦州，吉林靖宇，辽宁新宾。经何俊研究员鉴定分别为马兜铃科植物北细辛、汉城细辛以及华细辛表 1为不同批次细辛的来源。

2 方法 2.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C₁₈柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A相为0.1%甲酸水，B相为甲醇。梯度洗脱，洗脱梯度为：0~3 min，3% B；3~15 min，3%~50% B；15~20 min，50%~80% B。流速为1 mL/min，柱温：30 ℃，进样量：10 μL，检测波长285 nm。

2.2 对照品溶液的配制

精密称定细辛脂素，马兜铃酸A，芝麻素，卡枯醇，去甲乌药碱，槲皮素5.00 mg，加入5 mL甲醇进行溶解，得到浓度为1 mg/mL的各对照品储备液，并置于4 ℃冰箱冷藏备用。

2.3 供试品溶液的配制

分别称定10个不同批次的细辛5 g，加入纯水定容至50 mL，加热回流1 h，减压干燥得浸膏约0.45 g。精密称定浸膏5 mg，加水1 mL溶解，涡流振荡，14 000 r/min离心10 min，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，得上清液，置于4 ℃冰箱冷藏备用。

2.4 方法学考察 2.4.1 精密度实验

取同一批细辛供试品溶液（S1），按“2.1”项色谱条件连续进样6次，测得各个共有色谱峰的峰面积和相对保留时间，计算RSD，结果见表 2，结果表明此方法的精密度良好。

2.4.2 重复性实验

精密称定细辛药材水提物（S1）6份，每份5 g，按照“2.3”项制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样，测得各共有色谱峰的峰面积和相对保留时间，计算RSD，结果见表 2，结果表明此方法的重复性良好。

2.4.3 稳定性实验

取同一批细辛供试品溶液（S1），分别在时间点0、2、4、8、12、24 h下按“2.1”项色谱条件进样，测得各个共有色谱峰的峰面积和相对保留时间，计算RSD，结果见表 2，结果表明样品放置于室温24 h条件下稳定。

3 结果与分析 3.1 细辛HPLC指纹图谱建立和相似度分析

采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件（130723版，国家药典委员会，2012），对10批细辛药材水提物的实验结果和数据进行分析，采用多点校正法建立细辛药材水提物的指纹图谱，指纹图谱结果见图 1，共标定出20个共有峰，其中有6个特征峰，依次为6号峰（去甲乌药碱），16号峰（槲皮素），17号峰（卡枯醇），18号峰（马兜铃酸A），19号峰（芝麻素），20号峰（细辛脂素）。混合对照品图谱见图 2，10批细辛药材水提物的相似度分析结果见表 3。10批样品的相似度结果均在0.908以上，初步说明3种基源的细辛药材水提物质量相对均一稳定，推测这可能是北细辛、汉城细辛、华细辛3种基源的细辛均被药典收录的原因。

3.2 化学模式识别方法 3.2.1 聚类分析（HCA）

为了对指纹图谱的结果进行补充，本研究以10批细辛指纹图谱中20个共有峰的相对峰面积为变量，导入SPSS 25.0软件，采用组间联接法，以欧氏距离为测度进行聚类分析^[9]。聚类分析结果见图 3。结果表明，当距离刻度为15时，10批细辛药材水提物主要分为3类R1、R2、R3。R1中S6、S7、S8、S9均为北细辛，4批药材分别来源于山西长治、云南玉溪、辽宁锦州、吉林靖宇，4批药材的基源相同来源不同被分为了一类；R2中S4和S5均为北细辛，分别来源于辽宁沈阳和吉林白山；S1为华细辛，来源于辽宁盘锦；S10为汉城细辛，来源于辽宁新宾，4批药材中S4和S5与S1、S10的基源不同均来源于东北三省；R3中S2为北细辛，来源于辽宁丹东；S3为汉城细辛，来源于辽宁本溪。2批药材的基源不同均来源于辽宁省。10批细辛药材水提物的聚类结果表明不同产地及基源的细辛药材水提物间存在一定的质量差异。此外，聚类结果并不是按照药材的基源或者是药材的产地某单一变量作为划分，该结果为今后细辛药材水提物的质量研究提供参考。

3.2.2 偏最小二乘判别分析（PLS-DA）

为了印证HCA的结果，本研究以指纹图谱中20个共有峰的峰面积为变量，构建20×10的原始数据矩阵，使用SIMCA14.1统计软件对10批细辛药材水提物进行无监督模式的PLS-DA，Par作为标度化方式，绘制出PLS-DA 3D分析图，见图 4。由图 4可知R1、R2、R3分别聚集在不同的区域，其分类结果与HCA结果一致，印证了HCA的结果。说明不同产地及基源的细辛药材水提物间存在一定的质量差异。

3.2.3 正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）

为了进一步印证PLS-DA的结果，本研究以指纹图谱中20个共有峰的峰面积为变量，构建20×10的原始数据矩阵，使用SIMCA14.1统计软件对10批细辛药材水提物进行具有监督模式的OPLS-DA，见图 5。由模型分析验证参数可知，结实率参数R²X为0.807，区分参数R²Y为0.919，预测参数Q²为0.885，以上数据均大于0.5且原始数据矩阵中没有异常值，表明该模型稳定并且具有较好的预测准确性^[10-13]。由图 5可知R1、R2、R3分别聚集在不同的区域，其分类结果与PLS-DA的结果一致，印证了PLS-DA的结果。进一步说明了不同产地及基源的细辛药材水提物间存在一定的质量差异。

3.2.4 主成分分析（PCA）

为进一步评价不同基源和产地的细辛药材水提物的质量，本研究以10批细辛指纹图谱中20个共有峰的相对峰面积为变量，导入SPSS 25.0软件对10批细辛药材水提物进行PCA。结果将20个变量降维成5个主要成分，其方差累积贡献率为95.417%，综合了10批细辛药材水提物20个共有峰的大部分信息，相关矩阵的特征系数及方差贡献率见表 4。主成分综合得分和排序见表 5。结果对HCA、PLS-DA以及OPLS-DA的结果进行了补充。PCA结果表明10批细辛药材水提物中，S4得分最高，可初步认为来源于本溪的汉城细辛在10批细辛药材水提物中的质量相对较好，该结果为今后细辛药材水提物的质量研究提供参考。

得到的5个主成分的得分计算公式和综合得分计算公式如下

4 讨论

实验分别考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水流动相体系对色谱峰的影响，发现甲醇-0.1%甲酸水为流动相时，色谱峰峰形及分离效果较好。故选择甲醇-0.1%甲酸水作为流动相体系；对样品溶液进行254 nm，285 nm，320 nm检测波长进行考察，结果发现当检测波长为285 nm时基线相对平稳，所有色谱峰响应相对较大，故选择285 nm作为检测波长。

中药指纹图谱技术是一种能够用于鉴别中药真伪、区分基源、评价优劣以及保证其稳定性和一致性的高效快速的分析检测方法^[14]。但由于中药本身化学成分复杂，再加上产地不同、基源不同等影响因素，仅使用相似度评价系统并不能全面的、多层次的对中药材进行质量评价，需要结合其他分析方法对结果进行分析^[15-16]。

化学模式识别是使用统计学或数学方法将化学体系的测量值与体系的整体建立联系，广泛应用于中药材的鉴定、表征、质量评价及质量控制等研究中^[17]。化学模式识别分为无监督的模式识别和有监督的模式识别，在使用化学模式识别分析数据时，单独使用一种模式识别往往缺少科学性和代表性，因此常将两种模式结合起来相互验证、相互补充^[18]。本实验采HPLC法建立细辛药材水提物的指纹图谱，并将HCA、PLS-DA、OPLS-DA和PCA联合使用，对所得指纹图谱进行综合分析，将多种分析方法联合使用使得分析结果较大程度地避免了人为因素所带来的误差^[19]。几种分析结果相互验证相互补充，使得分析结果更加可靠^[20]。本实验初步评价了不同基源和产地的细辛药材水提物的质量。这些结果较好地阐明了细辛水提物内在的质量特征，并进一步完善了对于细辛药材的质量评价。