老年性皮肤瘙痒症（SP）是指发生在60岁以上老年人的无原发性皮肤损害而仅有瘙痒症状的一种神经功能障碍性皮肤病^[1]。文献报道SP患病率在18.9%~42.4%^[2-13]，且随着老年人年龄的增长而上升^[14]。SP患者临床表现主要为皮肤瘙痒、干燥及变薄，部分皮肤表面有糠状脱屑，瘙痒症状使患者产生搔抓行为，在长期搔抓过程中，SP患者皮肤可能会出现抓痕、血痂及皮肤增厚等，大大增加了患者皮肤感染的风险^[15-17]。同时，该病严重影响了SP患者的睡眠质量，导致其易产生焦虑抑郁等负面情绪^[18]。这使得患者的生活质量大幅度降低，严重损害患者身心健康。中医认为SP属于中医“痒风”“风瘙痒”范畴，其治疗原则为润燥止痒^[19]。猪肤汤是滋阴润燥的经典方剂，具有调节免疫、补中润燥、滋润皮肤的功效。课题组前期已将猪肤汤改良成猪肤汤软膏，并用于SP患者，具有较好的疗效。但是，关于中医药治疗SP的具体作用机制尚不清楚。中医诊疗讲究对疾病进行辨证论治，但查阅文献发现，目前尚没有SP病证结合动物模型，因此，本研究根据病证结合理论，先采用D-半乳糖注射结合丙酮、乙醚混合液刺激法建立SP动物模型，再采用低铁饲料喂养结合物理刺激建立血虚风燥证模型，以此构建SP血虚风燥证小鼠模型，为今后SP机制研究提供可选择的实验载体。

1 材料 1.1 动物

健康C57BL/6小鼠72只，每组样本量为12只，SPF级，体质量20~22 g，购于成都达硕实验动物有限公司，合格证号SCXK（川）2015-030。日常饮食为自来水和普通颗粒饲料。实验室自然光照、通风，相对湿度40%~60%，温度18~24 ℃。

1.2 药物 1.2.1 猪肤汤软膏

猪肤汤软膏是在经典方猪肤汤的基础上与合适基质混合均匀制备而成的膏剂。基质原材料：黄凡士林（上海商玺伟康医药用品有限公司）；硬脂酸（天津致远化学试剂有限公司）；单硬脂酸甘油酯（天津市大茂化学试剂厂）；液体石蜡（无锡市展望化工试剂有限公司）；十二烷基硫酸钠（上海埃彼化学试剂有限公司）；甘油（天津市福晨化学试剂厂）。制作方法：1）制作基质油相。取黄凡士林0.5 g、单脂酸甘油酯0.4 g、硬脂酸0.52 g及液体石蜡0.62 g，在75 ℃水浴加热融化、搅拌均匀，保持75 ℃。2）制作基质水相。取纯化水2.4 mL、十二烷基硫酸钠0.05 g及甘油0.5 g，75 ℃水浴加热融化、搅拌均匀，保持75 ℃。3）制备猪肤汤中浓度软膏。于75 ℃水浴下，将水相缓慢加入油相并搅拌均匀，待恢复至室温后，将5 g基质加入20 g猪肤汤搅拌均匀即可，此为临床试验所使用的浓度，即本实验猪肤汤中等浓度。4）制备猪肤汤高浓度软膏。将5 g基质加入10 g猪肤汤搅拌均匀即得。5）制备猪肤汤低浓度软膏。将5 g基质加入20 g猪肤汤搅拌均匀即得。

1.2.2 地奈德乳膏

本研究所使用的地奈德乳膏规格为0.05%，每支15 g，生产于重庆华邦制药股份有限公司。

1.3 仪器

1）搔抓行为测试设备：自制搔抓行为测试观察箱（9 cm×9 cm×13 cm），顶部留有直径约为1 cm的6个呼吸孔。2）组织学观察仪器：转轮式切片机（徕卡-2016，德国）；数码三目摄像显微镜（BA400Digital，麦克奥迪实业集团有限公司）；图像分析软件Image-Pro Plus 6.0（美国Media Cybernetics公司）。3）酶联免疫吸附（ELISA）测试仪器：电子恒温水浴锅（型号DZKW-4，北京中兴伟业仪器有限公司）；计算机（TFT185W80PS，冠捷显示科技有限公司）；酶标仪（SpectraMAX Plus384，美谷分子仪器有限公司）。

1.4 试剂

组织标本固定液（10%中性甲醛固定液）：多聚甲醛，批号：20180112，规格：500 g/瓶，国药集团化学试剂有限公司生产；磷酸缓冲盐溶液（PBS，0.01mmol/L，pH 7.2~7.4），批号ZLI-9062，2 L/袋，北京中杉金桥生物技术有限公司生产。Mouse白细胞介素（IL）-2 ELISA KIT，货号：ZC-37976，规格：96孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生产；Mouse IL-4 ELISA KIT，货号：ZC-37986，规格：96孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生产。

2 方法 2.1 动物分组

将72只C57BL/6小鼠按体质量由低到高依次排序，体质量相邻的6只为1个区组，共12个区组。每个区组内的6只小鼠再按照随机数字表法被随机分为6个处理组：空白组、模型组、地奈德乳膏组、猪肤汤软膏低浓度组、猪肤汤软膏中浓度组、猪肤汤软膏高浓度组。

2.2 实验造模 2.2.1 预实验

小鼠背部皮下注射500 mg/kg（0.5 mL），每日1次，连续42 d后对小鼠进行除毛。除毛后脱脂棉蘸取丙酮、乙醚混合液覆盖于除毛处15 s，后取另一脱脂棉蘸取蒸馏水在除毛处覆盖30 s，每日2次，共5 d，模拟SP疾病模型。第48天开始低铁饲料（每只小鼠每日8 g）喂养，同时进行冷风、碱水、化纤布料刺激（隔日1次，共2周）。

2.2.2 正式实验

首先通过皮下注射D-半乳糖造成小鼠衰老皮肤模型^[20]，然后采用丙酮、乙醚混合液建立慢性干燥性皮肤瘙痒动物模型^[21]，最后结合低铁饲料喂养和冷风、碱水、化纤布料等物理刺激造成血虚风燥证型^[22]，以构建SP血虚风燥证小鼠模型。

具体方法如下：1）对各组小鼠颈背部剪刀剃毛，6%硫化钠脱毛，实验过程中保持小鼠颈背部皮肤无毛状态。空白组皮下注射生理盐水（0.5 mL），其余各组小鼠予背部皮下注射D-半乳糖注射液500 mg/kg（0.5 mL），每日1次，连续42 d，造成小鼠皮肤衰老^[22]。2）第43天，空白组不给予任何处理，其余各组小鼠用脱脂棉蘸取丙酮、乙醚混合液覆盖于剪毛处15 s，而后取另一脱脂棉蘸取蒸馏水在剪毛处覆盖30 s，每日2次，共5 d，以此复制出SP疾病模型。3）除空白组小鼠外，其余各组小鼠于第48天开始低铁饲料（每只8 g/d）喂养，并同时将小鼠放入事先置入冰袋的鼠笼上下镂空的鼠笼中，使用电吹风冷风档对冰块进行吹风30 min；用60 ℃、pH=9的400 mL碳酸钠（Na₂CO₃）溶液从鼠笼顶部持续喷洒小鼠。冷风、Na₂CO₃溶液刺激完成后，将小鼠置于事前铺置细碎化纤布的鼠笼，并放置1个装有36 g变色硅胶的镂空小瓶。物理刺激隔日1次，共2周。

2.3 治疗方法

空白组小鼠不给予任何干预，自由饮水、进食。模型组小鼠造模成功后，不给予任何干预，自由饮水、进食。地奈德乳膏组造模成功后，采用地奈德乳膏涂抹颈背部皮肤。猪肤汤软膏低、中、高浓度组造模成功后，采用低、中、高浓度猪肤汤软膏（各含猪肤汤10、20、40 g）涂抹。给药剂量以将背部皮肤薄涂均匀为标准，每日2次，早上及晚上给药，2周为1个疗程，干预2个疗程，共28 d。

2.4 指标检测 2.4.1 小鼠一般情况观察

每日观察小鼠的证候评价指标：皮肤状态（有无干燥、脱屑等）、精神状况（有无精神萎靡不振、有无亢奋烦躁等）、摄食量、二便等。

2.4.2 小鼠表观指标评价

于造模前、造模后及干预后对小鼠进行搔抓行为测试和饮水量的观察。

2.4.3 小鼠病理指标评价 2.4.3.1 表皮厚度

干预结束后，将小鼠脱颈椎处死，取背部皮肤1 cm×1 cm，10%中性甲醛固定后，石蜡包埋，制作病理切片，行苏木精-伊红（HE）染色，显微镜下观察测试表皮厚度。

2.4.3.2 炎性细胞计数

干预结束后，将小鼠脱颈椎处死，取小鼠背部皮肤1 cm×1 cm，10%中性甲醛固定后，石蜡包埋，制作病理切片，行甲苯胺蓝染色，显微镜下观测肥大细胞计数。

2.4.4 小鼠生化指标评价 2.4.4.1 辅助T细胞（Th）1/Th2细胞因子水平

干预结束后，进行眼球取血，将其置于离心管内，4 ℃、3 000 r/min（离心半径11 cm）离心10 min后取血清，在-80 ℃低温条件下保存。按照ELISA试剂盒说明书，检测小鼠Th1/Th2肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-4水平。

2.4.4.2 皮肤羟脯氨酸（Hyp）表达

干预结束后，将小鼠脱颈椎处死，取小鼠背部皮肤1 cm×1 cm，按照ELISA试剂盒说明书，检测小鼠皮肤Hyp表达。

2.5 统计学方法

釆用SPSS 23.0软件进行统计分析。正态分布的计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析或重复测量方差分析，两两比较采用LSD法。P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 小鼠一般情况观察

造模前各组小鼠皮肤状况良好，眼神明亮，精神状况良好，摄食量正常，二便正常，行动敏捷。造模期间及造模完成后，空白组小鼠皮肤、精神、大便无明显变化。其余各组小鼠造模后烦躁不安、精神亢奋、易激惹、大便干燥，好爬至鼠笼顶部来回窜动，争抢饲料及垫料，甚至发生打斗，皮肤出现干燥、抓痕、脱屑，并伴有搔抓行为增多。实验开始前共72只小鼠，最终67只小鼠完成实验，5只小鼠死亡（模型组、地奈德乳膏组、猪肤汤软膏低、中、高浓度组各1只）。

3.2 小鼠表观指标评价

本研究采用小鼠搔抓行为和饮水量对小鼠的皮肤瘙痒程度进行评价。造模前各组小鼠搔抓行为和饮水量比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。造模后各组小鼠搔抓行为区组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），搔抓行为和饮水量组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）；干预后各组小鼠搔抓行为区组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），搔抓行为和饮水量组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较显示：干预后搔抓行为方面，模型组与空白组、地奈德乳膏组、猪肤汤软膏低、中、高浓度组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。干预后饮水量方面，模型组与空白组、地奈德乳膏组、猪肤汤软膏低、中、高浓度组比较，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表 1、表 2。

3.3 小鼠病理指标评价

本研究对干预后小鼠的表皮厚度和炎性细胞进行比较。1）表皮厚度：干预结束后，取小鼠背部皮肤制作病理切片，行HE染色，显微镜下观察测试表皮厚度。2）炎性细胞：行甲苯胺蓝染色，显微镜下观察肥大细胞计数。结果显示，干预后各组小鼠表皮厚度和炎性细胞区组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果显示，小鼠表皮厚度方面，模型组与空白组、地奈德乳膏组、猪肤汤软膏低、中、高浓度组相比，差异有统计学意义（P < 0.01）。猪肤汤软膏低浓度组与猪肤汤软膏高浓度组相比，差异有统计学意义（P < 0.01）。小鼠皮肤肥大细胞计数方面，模型组与空白组、地奈德乳膏组、猪肤汤软膏低、中、高浓度组相比，差异有统计学意义（P < 0.01）。见图 1、图 2、表 3。

3.4 小鼠生化指标评价

本研究对干预后小鼠的TNF-α、IL-4细胞因子和Hyp水平进行比较。1）TNF-α：干预结束后，取血清，ELISA法检测小鼠TNF-α细胞因子水平。2）IL-4细胞因子：干预结束后，取血清，ELISA法检测小鼠IL-4细胞因子水平。3）Hyp表达：干预结束后，采用ELISA法检测小鼠背部皮肤Hyp表达。结果显示，干预后各组小鼠TNF-α、IL-4细胞因子和Hyp水平区组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较显示，在TNF-α细胞因子方面，模型组与空白组、地奈德乳膏组、猪肤汤软膏高浓度组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。在IL-4细胞因子水平方面，模型组与空白组、猪肤汤软膏中、高浓度组比较，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；猪肤汤软膏低浓度组与猪肤汤软膏高浓度组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。在皮肤Hyp水平方面，模型组与空白组、猪肤汤软膏低、中、高浓度组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）；地奈德乳膏组与猪肤汤软膏低、中浓度组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 4。

4 讨论 4.1 造模方法的选择

具有中医病证特点、与临床病证特征基本一致的中医证候动物模型是研究中医病证本质的有力工具和研发创新中药的有力手段^[23]。文献显示，先病后证的造模思路是建立病证结合模型最理想的方法，也是目前使用最多的造模方法，尤其是在慢性病中应用广泛^[24-25]。故本研究采取先病后证的造模思路，即先进行疾病模型的构建，最后模拟血虚风燥证型。

有研究表明，D-半乳糖导致小鼠亚急性衰老模型与自然老化模型小鼠皮肤表现最为相似^[26-27]，且D-半乳糖致小鼠亚急性衰老操作简便、经济。结果显示，造模完成后，小鼠皮肤出现皱纹、变薄、萎缩及毛细血管扩张等皮肤衰老的表现。可见，注射D-半乳糖能够模拟皮肤衰老，是一种较为理想的皮肤衰老造模方法。目前，丙酮、乙醚混合液刺激是国际公认的瘙痒造模方法^[28-29]。因此，本研究采用丙酮、乙醚混合液刺激构建瘙痒模型。通过预实验发现丙酮、乙醚混合液刺激5 d后，对小鼠进行搔抓行为测试发现小鼠搔抓行为较造模前显著增加，且皮肤表面伴有干燥、糠状脱屑。可见，丙酮、乙醚混合液刺激较好地模拟了皮肤瘙痒，是一种操作方便、较为理想的瘙痒模型构建方法。回顾文献发现，SP证型模型报道较少，李文露等^[22]探索小鼠血虚风燥证的造模方法，造模后小鼠出现皮肤干燥、精神亢奋、饮水量增加及大便干燥等血虚风燥证表现。可见，低铁饲料喂养、冷风碱水、化纤布料刺激可较好地模拟小鼠血虚风燥的证型表现，是一种对小鼠损伤较小、方便可行的血虚风燥证造模方法。

综上，本研究在前人探索的基础上，使用D-半乳糖模拟皮肤衰老，采用丙酮、乙醚混合液刺激构建瘙痒模型，通过低铁饲料喂养结合物理刺激成功建立了血虚风燥证模型。

4.2 造模后SP血虚风燥证动物模型评价

2018年中华中医药学会中药实验药理专业委员会发布的《瘙痒动物模型制备与规范》指出判断瘙痒模型构建是否成功的核心指标为搔抓行为^[30]。本研究造模完成后，随机区组方差分析结果显示，造模后与空白组小鼠相比，其余各组小鼠搔抓行为明显增多（F=4.670，P < 0.01），说明SP疾病模型构建成功。对于动物模型的中医证候评价，2009年翟幸主编的由中国中医药出版社出版的《中医皮肤性病学》，明确SP血虚风燥证的诊断需具备主证、次证2项及以上。造模完成后，除空白组小鼠，其余各组小鼠造模后皮肤出现干燥、抓痕、脱屑、精神亢奋、烦躁不安、易激惹、打斗、好爬至鼠笼顶部来回窜动、争抢饲料及垫料、搔抓行为增多、大便干燥。由此，说明本实验的血虚风燥证模型构建成功。

4.3 猪肤汤软膏对SP血虚风燥证小鼠模型的评价

本研究以猪肤汤软膏对SP血虚风燥证小鼠模型进行了验证。结果显示：1）表观指标。与模型组比较，地奈德乳膏组和各浓度猪肤汤软膏组的搔抓行为和饮水量均降低（P < 0.01）。2）病理指标。与模型组比较，地奈德乳膏组和各浓度猪肤汤软膏组的肥大细胞计数降低（P < 0.01），表皮厚度增加（P < 0.01）。3）生化指标：与模型组比较，地奈德乳膏组和猪肤汤软膏高浓度组TNF-α降低（P < 0.05），猪肤汤软膏中、高浓度组IL-4升高（P < 0.05），各浓度猪肤汤软膏组的皮肤Hyp水平上升（P < 0.01）。结果说明猪肤汤软膏明显改善了SP小鼠模型的血虚风燥证表现。中医有“方证相应”之说，“方证相应”强调了方剂与其作用对象之间的相互作用，即方剂的功用是特定方药与其作用对象特定证之间相互作用的结果^[31]，故通过“以方验证”的方式可以反证证候模型是否构建成功。猪肤汤出自张仲景所著的《伤寒论》，含有猪肤、白蜜、白粉3味，是滋阴润燥的经典方。《伤寒论》指出猪肤咸寒入肾，肾阴上润肺阴，肺外合皮毛，具有润肺养皮、润燥解热的功效。已有研究表明采用猪肤汤治疗由血虚阴津不足引起的SP，患者瘙痒症状均得到了缓解^[32]。本研究结果显示，猪肤汤软膏能够有效改善SP血虚风燥证小鼠搔抓行为和血虚风燥的相关症状。因此，从“方证相关，以方验证”的评价角度证实了本实验模型的可靠性和稳定性。

5 结论

理想模型建立的标准需要具备相对稳定的组织学、生物化学和分子生物学特征，对干预反应性与人类相似并能够进行客观定量的分析。本研究采用D-半乳糖连续颈背部皮下注射结合丙酮、乙醚混合液刺激及低铁饲料喂养、综合物理刺激构建SP血虚风燥证动物模型，并从小鼠的表观指标、病理指标、生化指标对小鼠模型进行了评价，成功建立了SP血虚风燥证动物模型。通过不同浓度的猪肤汤软膏进行干预，发现该小鼠模型稳定、可靠。这种病证结合的造模方式符合中医病因病机及西医发病机制，值得推广应用。受研究条件的限制，本模型的实验室指标较少，有待进一步研究。