抑郁症在全球范围内广泛存在且发病率逐年增加，临床症状主要表现为对各种事物失去兴趣、缺乏快乐感、心情抑郁等，同时伴随入眠困难、缺乏食欲、体质量下降、性欲降低等，被世界卫生组织定义为最易引起患者伤残的十大疾病之一^[1-2]。抑郁症具体的发病机制目前尚无明确定义，临床上认为抑郁症可能与遗传、神经内分泌紊乱、神经递质水平、免疫功能紊乱等多种因素相关^[3-4]。近几年抑郁症患者相关数据分析显示，除遗传因素外，长期慢性应激也属于诱发抑郁症的重要原因^[5]。临床上治疗抑郁症常用药物有选择性5-羟色胺（5-HT）的再摄取抑制剂（氟西汀、舍曲林、帕罗西汀等）、单胺环氧化酶抑制剂、去甲肾上腺素再摄取抑制剂（NE）、三环和四环抗抑郁药（氯米帕明、米帕明、多赛平等），对于上述药物治疗效果差和严重的抑郁症患者常采用电抽搐治疗^[6-7]。西医治疗抑郁症虽应用广泛，但其疗效有限且伴随着药物依赖性和不良反应，在一定程度上限制了抑郁症患者药物的使用^[8]。因此，开发抗抑郁效果好且不良反应小的抑郁症治疗药意义重大。四逆散一方出自张仲景的《伤寒论》，具有调和肝脾、疏肝解郁的作用，被用于肝气郁结型抑郁症的治疗，大量临床数据证实四逆散能显著改善患者抑郁症症状。基于此本研究拟计划通过建立大鼠抑郁症模型，探究四逆散改善大鼠抑郁症的作用机制，为四逆散临床广泛应用提供更多基础数据。

1 实验材料 1.1 实验动物

150只7周龄SPF级SD雄性大鼠，体质量为250~270 g，购买于三峡大学实验动物中心，实验动物许可证号：SYXK（鄂）2017-0061。动物实验遵循减少（Reduction）、优化（Refinement）和替代（Replacement）的3R原则。

1.2 主要仪器试剂

四逆散配伍药材购自广州中医药大学附属医院；盐酸氟西汀胶囊（国药准字J20170022）购自礼来苏州制药公司；神经肽Y（NPY）、生长抑素（SS）、P物质（SP）放免检测试剂盒购自北京华英生物技术公司；NE、多巴胺（DA）、5-HT检测试剂盒购自美国TSZ生物贸易有限公司；细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）抗体、p-ERK1/2抗体、环磷酸腺苷反应结合蛋白（CREB）抗体、p-CREB抗体、脑源性神经营养因子（BDNF）、β-actin抗体均购自英国ABCAM公司。

BW-OF302旷场实验视频分析系统购买于上海软隆科技发展有限公司；MK3全自动酶标仪购自Eppendorf公司；Mini Protean 3 cell电泳仪购自美国BioRed公司。

2 实验方法 2.1 模型构建

150只大鼠随机抽取20只为正常组，其余130只根据参考文献[9]采用慢性温和不可预知性应激并联合单笼饲养的方式构建大鼠抑郁症模型，造模期间大鼠每日选择以下方式中的1种刺激大鼠：断食24 h、断水24 h、4 ℃冰水游泳5 min、夹尾1 min、更换潮湿垫料、50 mV电压电击足底、摇晃、昼夜颠倒，且连续两天刺激方式不得重复，持续处理4周，造模期间正常组自由饮食饮水。造模完成后观察大鼠状态，大鼠出现毛色暗沉、自主活动减少、体质量下降，糖水偏嗜降低，呈现出绝望、抑郁症状提示大鼠造模成功，造模成功大鼠共100只，模型成功率77%。

2.2 分组给药

将造模成功的100只大鼠随机分为模型组、四逆散低剂量组、四逆散中剂量组、四逆散高剂量组及氟西汀阳性对照组，每组20只。参考胡海燕等^[10]给药剂量配置生药浓度为1.33、2.66、5.32 g/mL的四逆散药液，分别灌胃给予四逆散低、中、高剂量组大鼠，氟西汀按0.5 mg/mL灌胃给药，每日每只灌胃给予2 mL，持续给药2周，正常组和模型组大鼠每日给予等量的生理盐水。

2.3 糖水消耗实验

给药结束后，各组大鼠禁食禁水24 h，每只动物测试时给予1瓶1%糖水溶液和1瓶纯水，大鼠自由饮水12 h后将两个瓶子取出，称质量，计算前后大鼠糖水消耗量、纯水消耗量、总液体消耗量以及糖水偏爱度。实验进行过程中保持环境安静。

糖水消耗量=实验前糖水重量-实验结束糖水后糖水重量。

纯水消耗量=实验前纯水重量-实验结束后纯水重量。

总液体消耗量=纯水消耗量+糖水消耗量。

糖水偏爱度=糖水消耗量/总液体消耗量×100%。

2.4 旷场实验

给药结束后，进行旷场实验，旷场实验开始之前1 h，将大鼠放置到测试房间内适应1 h。实验开始后捏住大鼠尾巴小心放入箱体中央，大鼠适应10 s后开始用摄像系统全程记录大鼠进入箱体内3 min自主活动情况，以大鼠身体超过50%进入其他方格记作水平运动得1分，大鼠双前肢离开箱子底部记作直立次数得1分，以水平运动得分和直立次数得分总和记作大鼠矿场运动评分，每只鼠测试完成后彻底打扫实验箱体，去除大鼠排泄物及异味，测试过程中保证测试环境安静。

2.5 海马组织神经递质测定

给药结束后，首先将大鼠麻醉，腹主动脉取血收集大鼠血液样本，4 ℃环境下3 500 rpm离心10 min收集大鼠血清后将其置于-80 ℃冰箱保存待测；然后处死大鼠，小心分离大鼠海马组织，称质量后按每10 mg组织加90 μL PBS的量加入对应体积的预冷PBS，置于冰上研磨制作组织匀浆，研磨结束后4 ℃条件下3 500 r/min离心10 min，收集上清至干净微型离心（EP）管中，根据酶联免疫吸附实验（ELISA）检测试剂盒步骤检测组织匀浆中NE、DA、5-HT含量，神经递质水平以ng/g脑组织质量表示。

2.6 血清NPY、SP、SS含量测定

取上述冻存各组大鼠血清样本，然后根据放免试剂盒检测说明书步骤血清中NPY、SP、SS含量。

2.7 大鼠皮质ERK1/2-CREB-BDNF信号通路检测

给药结束后，收集大鼠皮质组织，提取组织蛋白，通过BCA蛋白定量法检测蛋白浓度，每组取20 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳分离：浓缩胶80 V电泳40 min，分离胶120 V电泳50 min将蛋白按分子量大小分离；随后进行湿转，将蛋白转移至PVDF膜上；脱脂奶粉封闭2 h；TBST洗膜后，加入ERK1/2、p-ERK、p-CREB、BDNF及β-actin一抗抗体（抗体稀释比1∶1 000）孵育，4 ℃孵育过夜；洗膜；加入HRP标记的山羊抗兔二抗抗体（1∶5 000）；最后利用ECL化学发光试剂显色，检测各个蛋白含量，以β-actin为内参对照。

2.8 统计学处理方法

本实验中所有实验数据均利用SPSS 18.0和GraphPadPrism 8软件进行处理、分析和作图，数据均以均数±标准差（x±s）表示。多组间两两比较采用单因素方差检验。P < 0.05表示差异有统计学意义。

3 结果 3.1 大鼠行为学检测

给药结束后，各组大鼠进行糖水偏爱度检测和矿场实验。实验结果显示，与正常组相比，模型组大鼠糖水偏爱度和旷场运动评分均显著降低（P < 0.001）；与模型组相比，阳性对照组及四逆散低、中、高剂量组大鼠糖水偏爱度和旷场运动评分均显著增加（P < 0.001）；与阳性对照组相比，四逆散低、中、高剂量组糖水偏爱度和旷场运动评分较低（P < 0.05），见表 1。

3.2 大鼠海马组织神经递质含量测定

给药结束后，收集大鼠海马组织，检测海马组织中NE、DA和5-HT含量。实验结果显示，与正常组相比，模型组大鼠海马组织中NE、DA和5-HT均显著下调（P < 0.001）；与模型组相比，阳性对照组及四逆散低、中、高剂量组大鼠海马组织中NE、DA和5-HT均显著上调（P < 0.001）；与阳性对照组相比，四逆散低、中剂量组大鼠NE和5-HT及低、中、高剂量组大鼠DA含量均较低（P < 0.01），高剂量组大鼠海马组织中NE和5-HT含量较阳性对照组无明显差异（P > 0.05），见表 2。

3.3 大鼠血清NPY、SP、SS含量测定

给药结束后，收集大鼠血清样本，检测大鼠血清中NPY、SP、SS含量。实验结果显示，与正常组相比，模型组组大鼠血清中NPY和SS含量均显著降低（P均 < 0.001），SP含量显著增加（P均 < 0.001）；与模型组相比，阳性对照组及四逆散低、中、高剂量组大鼠血清中NPY和SS含量均显著增加（P均 < 0.001），SP含量均显著降低（P均 < 0.001）；与阳性对照组相比，四逆散低、中剂量组大鼠血清NPY含量无明显差异（P > 0.05），高剂量组大鼠血清中NPY含量显著增加（P < 0.001）；四逆散低、中、高剂量组大鼠血清SP较阳性对照组均显著升高（P均 < 0.01）；四逆散低剂量组大鼠SS含量较阳性对照组显著降低（P < 0.001），中、高剂量组大鼠SS含量较阳性对照组无明显差异（P > 0.05），见表 3。

3.4 大鼠皮质ERK1/2-CREB-BDNF信号通路检测

实验结束后，收集大鼠皮质，检测皮质组织中ERK1/2-CREB-BDNF信号关键蛋白表达情况。实验结果显示，与正常组相比，模型组大鼠皮质中p-ERK1/2、p-CREB、BDNF表达量均显著下调（P < 0.001）；与模型组相比，阳性对照组及四逆散低、中、高剂量组大鼠皮质中p-ERK1/2、p-CREB、BDNF表达量均显著上调（P < 0.01）；与阳性对照组相比，四逆散低、中剂量组大鼠脑组织中p-ERK1/2及p-CREB表达量较低（P < 0.05），四逆散低剂量组BDNF表达量较低（P < 0.05），四逆散中剂量组BDNF表达量与阳性对照组无显著差异（P > 0.05）；四逆散高剂量组大鼠脑组织中p-ERK1/2及p-CREB表达量与阳性对照组无显著性差异（P > 0.05），BDNF表达量显著高于阳性对照组（P < 0.05），见图 1，表 4。

4 讨论

抑郁症是目前发病率较高的情感性精神障碍疾病，该病具体发病机制尚不明确，西医治疗效果较为一般，且伴随较多不良反应^[11]。在传统中医理论体系中认为抑郁症的病因是七情所伤，而肝气郁结则直接引发抑郁症，因此疏肝解郁是目前中医治疗抑郁症的主要出发点^[12]。四逆散由柴胡、芍药、甘草、枳实4味中药材配伍组成，其中君药柴胡入肝、胆经，疏肝解郁、清轻升散，臣药芍药养血敛阴以柔肝，佐药枳实泄热破结、理气解郁，使药甘草益脾和中，四药相合，共奏疏肝理脾、透邪解郁之效，临床上被广泛应用于抑郁症及肝胆、脾胃失调等多种疾病的治疗^[13]。四逆散对抑郁症的治疗虽在临床上取得较好的效果，但该方具体的作用机制尚未阐明。因此本研究建立大鼠抑郁症模型，探究四逆散治疗抑郁症作用机制。

抑郁症患者临床表现主要包括自主活动减少、情感缺失、体质量下降等，糖水消耗实验和旷场实验是用来评价实验动物抑郁状态最常用的行为学检测方法，糖水偏爱度是目前评价大鼠抑郁最重要的公认的指标之一，糖水偏爱度降低显示大鼠快感反应缺失；旷场运动评分是评价大鼠心理状态和情绪的经典方法，大鼠活动次数降低，提示大鼠对新环境的好奇度减低^[14-15]。本研究利用糖水消耗实验和旷场实验评价给药后各组大鼠抑郁情况，实验结果显示，与正常组相比，模型组大鼠糖水偏爱度和旷场运动评分均显著降低，提示大鼠处于抑郁状态；给予大鼠不同剂量四逆散治疗后，其糖水偏爱度和旷场运动评分均显著增加，且高剂量四逆散治疗效果较好，提示大鼠抑郁症显著改善。

抑郁症患者情绪抑郁与神经系统信号转导异常密切相关，在近几年的研究中单胺类神经递质5-HT、DA、NE在抑郁症中的重要性逐渐显露^[16]。葛明广^[17]的研究中发现抑郁症患者体内5-HT、DA、NE含量显著降低。李明等^[18]研究也显示四逆散可显著提高抑郁症模型大鼠脑组织中神经递质5-HT、DA、NE含量，且5-HT、DA、NE含量降低的水平与抑郁症的程度高度相关。本研究中发现，抑郁症模型组大鼠海马组织中5-HT、DA、NE含量均显著下调，给予不同剂量四逆散治疗后大鼠海马组织中5-HT、DA、NE含量均显著上调，且四逆散高剂量组对5-HT和NE的上调能力与阳性对照氟西汀的作用无明显差异，提示高剂量四逆散具有较好的抗抑郁作用，和与上述文献报道类似。

抑郁症的发病机制虽尚不明确，但可以确定的是神经肽在该过程中扮演着重要角色，但关于神经肽SS、SP及NPY与抑郁症相关性的研究不多，NPY是广泛分布于脑组织中的一种神经多肽，在调节行为应激和情感中发挥重要作用，海马内NPY能减轻机体对过度应激刺激造成的损伤；SS属于神经系统内广泛存在的递质，可促进5-HT和DA的释放、活化海马中突出功能，继而影响记忆力；SP可与情绪相关的神经递质通路发生交叉反应，参与人认知和情感的调节^[19]。冯劼等^[20]研究发现四逆散可通过下调血清SS、SP及NPY水平发挥抗抑郁作用。本研究中发现，模型组大鼠血清中NPY和SS含量显著降低，SP含量显著增加；给予低、中、高剂量四逆散治疗后大鼠血清中NPY、SS含量均呈现不同程度上调，同时SP呈不同程度下调，且高剂量四逆散对NPY的上调作用更加明显，低、中剂量四逆散对NPY的上调作用及中、高剂量的四逆散对SS的上调作用与阳性药氟西汀作用无明显差异，与冯等研究具有一定差异，提示四逆散可能通过调节血清神经肽含量平衡改善抑郁症，但其对SS、SP及NPY的具体调节作用尚不清楚。

ERK1/2属于哺乳动物细胞中丝裂原活化蛋白激酶通路中的重要一员，被磷酸化激活后进入细胞核并通过磷酸化作用激活CREB，发挥调节细胞功能的作用，在抑郁症患者海马组织和前额叶皮质中可检测到ERK1/2磷酸化显著降低^[21]。海马组织中ERK1/2-CREB信号通路与抑郁症患者快感缺乏密切相关，也是介导BDNF发挥功能的重要途径，已有研究报道，提高大鼠脑组织中ERK1/2-CREB-BDNF通路关键蛋白表达和磷酸化作用，能显著改善大鼠抑郁行为^[22]，且Cao等^[23]研究发现四逆散可通过BDNF/PKA/CREB通路改善大鼠抑郁。本研究中发现，四逆散可显著上调大鼠脑皮质中ERK1/2、CREB磷酸化水平，促进BDNF表达，发挥保护和促进损伤神经元细胞修复作用，改善大鼠抑郁症症状，且高剂量四逆散对BDNF的上调作用较氟西汀明显。

综上所述，四逆散可通过上调海马组织神经递质NE、DA、5-HT含量；提高血清中神经肽NPY、SS水平，并下调神经肽SP水平；促进ERK1/2-CREB-BDNF通路关键蛋白磷酸化，上调通路活性，进而发挥改善大鼠抑郁样行为的作用。