2023, Vol. 42文章信息
- 李明, 袁金斌, 张逊, 冯昊, 任晓静
- LI Ming, YUAN Jinbin, ZHANG Xun, FENG Hao, REN Xiaojing
- 基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析吴茱萸的化学成分
- Analysis of chemical constituents from Evodia rutaecarpa by UHPLC-Q-TOF-MS/MS
- 天津中医药大学学报, 2023, 42(2): 212-217
- Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2023, 42(2): 212-217
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2023.02.15
-
文章历史
收稿日期: 2022-08-20
2. 江西中医药大学, 南昌 330004;
3. 唐山市协和医院, 唐山 063000
2. Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China;
3. Tangshan Union Hospital, Tangshan 063000, China
吴茱萸是中医临床常用药材，具有温中、止痛、理气、燥湿等功效[1]。现代研究表明，吴茱萸具有镇痛[2-3]、止呕[4]、抗炎、抗感染[5]等活性。吴茱萸的化学成分复杂，迄今为止的实验研究表明，吴茱萸含有多种化学成分，包括生物碱类、黄酮苷类、苯丙素类、柠檬苦素类、有机酸类以及蒽醌类化合物[6]。目前，研究吴茱萸的化学成分主要通过柱色谱分离法，先制备得到单体，然后利用质谱、核磁等波谱技术鉴定其化学结构，这种方法存在诸如分离难度大，研究周期冗长等缺点。近年来，随着UHPLC-Q-TOF-MS/MS的发展，其在分析鉴定中药化学成分方面具有高分离效率、高分辨率、高灵敏度等特点[7]，能够准确提供所测化学成分的分子量，现被广泛应用于复杂样品的分析中。本实验通过UHPLC-Q-TOF-MS/MS测定方法，快速、精准地分析吴茱萸化学成分，为研究吴茱萸毒性成分和药效成分打下基础。
1 仪器与材料 1.1 仪器Nexera X2高效液相色谱仪（日本岛津公司），配有脱气器、自动进样器、柱温箱、二元泵和检测器等；质谱仪（ABSCIEX Triple TOF 5600+，AB公司）；电子分析天平（AE-240，北京赛多利斯仪器有限公司）。
1.2 试药吴茱萸药材采自江西省新干县，采收时间为2018年8月中旬，经江西中医药大学杨武亮教授鉴定为芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa（Juss.）Benth.干燥近成熟的果实。
乙腈、甲醇为色谱纯（TEDIA）；甲酸、乙醇为分析纯（西陇化工）；实验室自制超纯水。
吴茱萸碱（批号：110801200304）、吴茱萸次碱（批号：110802200505）、去氢吴茱萸碱（批号：110800200404）购于中国药品生物制品检定所。
2 方法与结果 2.1 供试品溶液的制备选取一定量吴茱萸药材，经烘干、粉碎、过3号筛后备用，称取5 g吴茱萸药材粉末，放置于100 mL锥形瓶中，加入50 mL 75%乙醇，加热回流提取2 h，抽滤，保留滤液，残渣再加50 mL 70%乙醇，加热回流提取1 h，抽滤后两次滤液合并，经真空蒸馏后回收至无乙醇气味，浓缩干燥后得到吴茱萸浸膏，溶于适量甲醇，稀释至10.0 mL容量瓶中，摇匀，用0.22 μm微孔膜过滤，得供试品溶液。
2.2 混合对照品溶液的制备精密称取吴茱萸碱0.005 32 g、吴茱萸次碱0.005 81 g和去氢吴茱萸碱0.006 04 g，放置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，用0.22 μm微孔膜过滤，得混合对照品溶液。
2.3 色谱条件ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相为水（0.2%甲酸）-乙腈（0.2%甲酸），流动相洗脱如表 1；流速为0.3 mL/min；温度30 ℃；进样量为5 μL。
ESI离子源，正负离子扫描模式，脱溶剂气体为N2，正离子模式下，毛细管电压为5 500 V，离子温度为600 ℃，扫描范围（m/z）50~2 000 Da；负离子模式下，毛细管电压为4 500 V，离子温度为500 ℃，扫描范围（m/z）100~2 000 Da。
2.5 UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析查阅吴茱萸相关文献，建立吴茱萸化学成分数据库，对于混合对照品溶液和供试品溶液的质谱数据，运用PeakView软件对数据进行分析。使用XIC Manager功能建立吴茱萸已知成分数据库。通过质谱测定各色谱峰对应的分子式，与已建立的数据库进行匹配，初步鉴定各成分，最后使用Formula Finder功能结合保留时间、二级碎片、裂解碎片等信息共鉴定出64个化合物的结构。总离子流图见图 1，具体分析结果见开放科学（资源服务）标识码（OSID）。
|
| 注：A.正离子模式；B.负离子模式。 图 1 吴茱萸样品UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析的BPI |
根据质谱中化合物的结构特征和典型的碎片离子，从吴茱萸药材70%乙醇提取物中鉴定了42个生物碱，主要为吲哚类、喹诺酮类和糖苷类生物碱。
吲哚类生物碱化学式中包含3个氮原子，在质谱碰撞电压轰击下容易发生Retro Diels-Alder（RDA）裂解，形成吲哚类生物碱特征离子峰。吴茱萸碱与吴茱萸次碱的裂解方式如图 2。化合物40，检测到该化合物tR=32.62 min，分子式为C19H17N3O，m/z 304.1437 [M+H]+为准分子离子峰。其MS2图中含有碎片离子171.090 2、161.069 8、144.080 0和134.060 0，碎片离子171.090 2和134.060 0是吴茱萸碱发生RDA裂解产生的特征碎片离子。[M+H-C10H10N]+（m/z 161.069 4）和[M+H-C9H8N2O]+（m/z 144.079 6）则是吴茱萸碱发生RDA裂解后由于分子内双键的重排产生的特征碎片离子，所以推断为吴茱萸碱。
|
| 图 2 吴茱萸碱（A）和吴茱萸次碱（B）的裂解示意图 |
化合物44，所测分子式为C18H13N3O，m/z 288.113 6 [M+H]+为其准分子离子峰，比化合物40少16 Da，表明脱去了一个CH4基团。在MS2图中检测到273.087 2、244.084 9、169.074 8等碎片离子，273.0872是母离子288.1136脱去一分子CH4产生的，244.084 9和169.074 8是吴茱萸碱经RDA裂解后产生的特征碎片离子。推断为吴茱萸次碱。
喹诺酮类生物碱母核相同，差异仅在侧链的碳数及双键位置即侧链的长度、不饱和度不同。以化合物45为例，测到其化学式为C23H35NO2，其MS2图中含有碎片离子340.263 6、298.215 6、284.201 7、242.148 6、200.106 7、186.090 6、173.082 8、159.065 7，碎片离子340.263 6是母离子358.274 8脱去一分子H2O产生的。碎片离子159.065 7表明化合物45有N-甲基-4（1H）母核，如图 3所示。以上碎片信息与喹诺酮类化合物1-Methyl-2-[12-hydroxy-tridecyl]-4（1H）-quinolone碎片信息相符合[10]，因此推断化合物45为1-甲基-2-[12-羟基-十三烷基]-4（1H）-喹诺酮。
|
| 图 3 1-甲基-2-[12-羟基-十三烷基]-4（1H）-喹诺酮的裂解示意图 |
糖苷类生物碱以化合物22为例。化合物22，tR=17.57 min时，正离子模式下准分子离子峰[M+H]+为m/z 612.222 6。该成分在MS2图中给出了466.163 2和304.108 9的碎片离子，碎片离子466.163 2是母离子612.222 6脱去一个146 Da的鼠李糖Rha（146 Da）产生的碎片离子[M+H-Rha]+，304.108 9为碎片离子612.222 6再丢失1个Glc残基产生的碎片离子[M+H-Rha-Glc]+得到的，对照参考文献[11]，推测化合物22为吴茱萸次碱-10-O-芸香糖苷，其特征裂解方式如图 4所示。
|
| 图 4 吴茱萸次碱-10-O-芸香糖苷的裂解示意图 |
吴茱萸70%醇提物中共鉴定出8个柠檬苦素类化合物，因正负离子模式均有响应，选择正负离子模式。以化合物31为例，在tR=28.87 min时，分子离子峰m/z 486.188 9[M-H]-，二级碎片给出了423.180 5、397.164 8、365.139 0和259.132 7碎片离子，与文献[10, 21]报道的吴茱萸苦素质谱数据相同，推断化合物31为吴茱萸苦素。
2.6.3 黄酮苷类化合物的质谱解析吴茱萸70%醇提物鉴定出8个黄酮苷类化合物，例如化合物12，在tR=11.28 min处检测到化学式为C15H10O7，m/z 303.050 2[M+H]+为其准分子离子峰。该成分在MS2图中明显的碎片离子有m/z 285.040 5、257.043 5和229.048 9。285.0405是母离子m/z 303.050 2脱去一个H2O产生的；257.0435和229.0489分别对应[M+H-H20-CH3-CO]+和[M+H-H2O-CH3-2CO]+碎片离子，这与文献报道[14]的槲皮素的质谱数据相同。得出该化合物为槲皮素。
2.6.4 苯丙素类化合物的质谱解析化合物2，4，5的保留时间分别为2.19，3.41，3.88，但是其分子式都为C16H18O9，在负离子模式下，准分子离子峰相同，推断为同分异构体，结合碎片离子191.056 4和161.025 0，191.056 4是经酯键水解后产生的奎宁酸负离子，161.025 0是分子失去1个奎宁酸残基后，再失去1个H2O分子得到的，结合文献质谱数据[9]，确定化合物2为新绿原酸，化合物4为绿原酸，化合物5为隐绿原酸。
2.6.5 其他化合物的质谱解析除了生物碱，柠檬苦素类，黄酮苷类，苯丙素类成分以外，还鉴定了3个其他类型化合物。如化合物3，在tR=3.15 min处检测到化学式为C15H18O10，m/z 715.172 2[2M-H]-为其准分子离子峰。该成分在MS2图中有357.082 0和195.051 5等碎片。[C6H12O7-H]-（m/z 195.051 5）是经酰氧键断裂产生的特征碎片，结合文献数据[10]，化合物3鉴定为反式咖啡酰葡萄糖酸。
化合物9：tR=5.88 min，化学式为C15H10O5，碎片离子有215.067 7、197.061 4、169.061 4，碎片离子215.067 7是母离子271.060 6脱去一分子H2O和一分子CO产生的，接着丢失1分子H2O得到碎片离子197.061 4，最后脱去一个H2O分子得到碎片离子169.061 4，以上碎片信息与大黄素相符合[13]，因此化合物9被推断为大黄素。
3 讨论为了全面深入地探究吴茱萸的化学成分，本实验比较了正负模式总离子流图，结果发现正模式下峰的数量更多，质谱响应更强，但是黄酮苷类、有机酸类和柠檬苦素类在正离子模式下响应偏低，所以本实验采用了正离子模式与负离子模式对吴茱萸醇提物进行分析。此外，对二级碰撞能量进行了考察，选择30、35、40 V 3个碰撞能量进行对比，发现35 V下，碎片离子种类丰富且干扰偏少。
本实验运用UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法对吴茱萸醇提取物进行分析，新型的TOF系统特点包括高分离效率、高分辨率、高灵敏度、提供分子量信息等，广泛应用于各种化合物的分析。本研究共鉴定出64个化合物，包括生物碱类、黄酮苷类、柠檬苦素类、苯丙素类、有机酸类以及蒽醌类化合物，本实验建立了一种对吴茱萸化学成分快速研究分析的方法，能够鉴定出更多的化合物，为研究吴茱萸毒性成分和药效成分打下基础。
| [1] |
国家药典委员会. 中华人民共和国药典: 2020年版[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020: 178-179. National Pharmacopoeia Commission. People's republic of China (PRC) pharmacopoeia: 2020 edition[M]. Beijing: China Medical Science Press, 2020: 178-179. |
| [2] |
MATSUDA H, WU J X, TANAKA T, et al. Antinociceptive activities of 70% methanol extract of evodiae fructus (fruit of Evodia rutaecarpa var. bodinieri) and its alkaloidal components[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 1997, 20(3): 243-248. |
| [3] |
KO H C, WANG Y H, LIOU K T, et al. Anti-inflammatory effects and mechanisms of the ethanol extract of Evodia rutaecarpa and its bioactive components on neutrophils and microglial cells[J]. European Journal of Pharmacology, 2007, 555(2/3): 211-217. |
| [4] |
谢一辉, 张雨恬, 罗金荣, 等. 热性中药吴茱萸药性成分研究[J]. 中国中医药信息杂志, 2014, 21(7): 77-80. XIE Y H, ZHANG Y T, LUO J R, et al. Study on composition of drug property of hot-natured herb euodiae fructus[J]. Chinese Journal of Information on Traditional Chinese Medicine, 2014, 21(7): 77-80. DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2014.07.023 |
| [5] |
LIANG X G, LI B, WU F, et al. Bitterness and antibacterial activities of constituents from Evodia rutaecarpa[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2017, 17(1): 180. DOI:10.1186/s12906-017-1701-8 |
| [6] |
张璐, 冯育林, 王跃生, 等. 吴茱萸现代研究概况[J]. 江西中医学院学报, 2010, 22(2): 78-82. ZHANG L, FENG Y L, WANG Y S, et al. Modern research status on Evodia rutaecarpa[J]. Journal of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, 2010, 22(2): 78-82. DOI:10.3969/j.issn.1005-9431.2010.02.027 |
| [7] |
YUAN J B, CHEN Y, LIANG J, et al. Component analysis and target cell-based neuroactivity screening of Panax ginseng by ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B, 2016, 1038(3): 1-11. |
| [8] |
马微, 马强, 朱明达, 等. 超高效液相色谱-串联质谱测定减肥保健食品中辛弗林及其电喷雾质谱裂解途径研究[J]. 分析科学学报, 2010, 26(6): 636-640. MA W, MA Q, ZHU M D, et al. ESI fragmentation studies and determination of synephrine in the weight-loss functional foods by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Analytical Science, 2010, 26(6): 636-640. |
| [9] |
程宇欣, 陈两绵, 王智民, 等. UHPLC-QTOF-MS法分析鉴定吴茱萸水提物在大鼠血浆、尿液和粪便中的原形成分及其代谢产物[J]. 药学学报, 2017, 52(7): 1157-1164. CHENG Y X, CHEN L M, WANG Z M, et al. Analysis of major bioactive components and their metabolites in rats' plasma, urine and feces after oral administration of the aqueous extract of Euodiae Fructus by UHPLC-QTOF-MS[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2017, 52(7): 1157-1164. |
| [10] |
LING Y, HU P, ZHANG L F, et al. Identification and structural characterization of acylgluconic acids, flavonol glycosides, limonoids and alkaloids from the fruits of Evodia rutaecarpa by high performance liquid chromatography coupled to electrospray ionization and quadrupole time-of-flight mass spectrometry[J]. Journal of Chromatographic Science, 2016, 54(9): 1593-1604. DOI:10.1093/chromsci/bmw109 |
| [11] |
苏秀丽, 印敏, 徐曙, 等. UPLC-Q-TOF-MS法分析吴茱萸化学成分[J]. 中成药, 2017, 39(6): 1223-1227. SU X L, YIN M, XU S, et al. Analysis of chemical constituents in Evodia rutaecarpa by UPLC-Q-TOF-MS[J]. Chinese Traditional Patent Medicine, 2017, 39(6): 1223-1227. |
| [12] |
张晓拢, 经雅昆, 彭四威, 等. 吴茱萸的化学成分研究[J]. 天然产物研究与开发, 2013, 25(4): 470-474. ZHANG X L, JING Y K, PENG S W, et al. Chemical constituents from the nearly ripe fruits of Evodia rutaecarpa (juss.) Benth[J]. Natural Product Research and Development, 2013, 25(4): 470-474. DOI:10.3969/j.issn.1001-6880.2013.04.009 |
| [13] |
盖玲, 饶高雄, 宋纯清, 等. 石虎化学成分研究[J]. 药学学报, 2001, 36(10): 743-745. GAI L, RAO G X, SONG C Q, et al. Studies on the chemical constituents of evodia rutaecarpa(juss.) Benth. var. officinalis (dode) Huang[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2001, 36(10): 743-745. |
| [14] |
李宇航, 戴海学, 汪明明, 等. 槲皮素的电喷雾离子阱质谱分析[J]. 质谱学报, 2009, 30(6): 374-378. LI Y H, DAI H X, WANG M M, et al. Elucidation of quercetin by electron spray ionization mass spectrometry[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2009, 30(6): 374-378. |
| [15] |
LI W L, SUN X M, LIU B M, et al. Screening and identification of hepatotoxic component in Evodia rutaecarpa based on spectrum-effect relationship and UPLC-Q-TOFMS[J]. Biomedical Chromatography: BMC, 2016, 30(12): 1975-1983. |
| [16] |
胡传芹, 杨鑫宝, 杨秀伟, 等. 吴茱萸中的黄酮苷类化合物[J]. 中国中药杂志, 2012, 37(17): 2571-2575. HU C Q, YANG X B, YANG X W, et al. Flavonoid glycosides from dried and nearly ripe fruits of Evodia rutaecarpa[J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2012, 37(17): 2571-2575. |
| [17] |
王雅蟳, 龚慕辛, 王智民, 等. 吴茱萸属植物化学成分研究概述[J]. 中国药学杂志, 2010, 45(9): 641-646. WANG Y X, GONG M X, WANG Z M, et al. Review on chemical constituents of Evodia plants[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2010, 45(9): 641-646. |
| [18] |
赵楠, 李占林, 李达翃, 等. 吴茱萸中1个新的苯丙素苷类化合物[J]. 中草药, 2015, 46(1): 15-18. ZHAO N, LI Z L, LI D H, et al. A new phenylpropanoid glycoside from Euodia rutaecarpa[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2015, 46(1): 15-18. |
| [19] |
王晓霞, 高慧媛, 姜勇, 等. 吴茱萸化学成分研究[J]. 中草药, 2013, 44(10): 1241-1244. WANG X X, GAO H Y, JIANG Y, et al. Chemical constituents from fruits of Euodia rutaecarpa[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2013, 44(10): 1241-1244. |
| [20] |
夏梦雯, 潘争红, 程玲, 等. 丽江吴萸化学成分研究[J]. 中国药学杂志, 2016, 51(9): 694-697. XIA M W, PAN Z H, CHENG L, et al. Chemical constituents of fruits from Evodia delavayi[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2016, 51(9): 694-697. |
| [21] |
李文兰, 孙向明, 陈晨, 等. 基于UPLC-Q-TOF MS的吴茱萸致肝毒性部位及入血成分分析[J]. 质谱学报, 2017, 38(3): 282-293. LI W L, SUN X M, CHEN C, et al. Analysis of Euodia rutaecarpa hepatotoxic part and absorbed components in rat serum based on UPLC-Q-TOF MS[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2017, 38(3): 282-293. |
| [22] |
YANG S S, TIAN M, YUAN L, et al. Analysis of E. rutaecarpa alkaloids constituents in vitro and in vivo by UPLC-Q-TOF-MS combined with diagnostic fragment[J]. Journal of Analytical Methods in Chemistry, 2016, 2016(11): 4218967. |
| [23] |
楼璐璐, 徐姗姗, 方淡思. 吴茱萸化学成分与质量控制研究进展[J]. 中华中医药学刊, 2017, 35(8): 2154-2157. LOU L L, XU S S, FANG D S. Research progress in chemical components and quality control of fructus evodiae rutaecarpae[J]. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine, 2017, 35(8): 2154-2157. |