2023, Vol. 42文章信息
- 李巍, 吴新龙, 丁辉, 尹佳鑫, 杨文志, 宋新波, 李正, 余河水
- LI Wei, WU Xinlong, DING Hui, YIN Jiaxin, YANG Wenzhi, SONG Xinbo, LI Zheng, YU Heshui
- 基于HS-GC-IMS和HS-SPME-GC-MS技术对清感秋饮中挥发性成分的全面表征
- Comprehensive characterization of volatile organic compounds in Qinggan Qiuyin based on HS-GC-IMS and HS-SPME-GC-MS
- 天津中医药大学学报, 2023, 42(2): 218-223
- Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2023, 42(2): 218-223
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2023.02.16
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文章历史
收稿日期: 2022-08-30
2. 组分中药国家重点实验室, 天津 301617;
3. 现代中医药海河实验室, 天津 301617
2. Medicine State Key Laboratory of Provincial and Ministerial Co-construction of Component Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China;
3. Haihe Laboratory of Modern Chinese Medicine, Tianjin, 301617
茶是中国传统的饮料，具有多种保健功能，其中清热、解毒、止咳是最重要的功能[1]。外观、香气、口感等因素决定了茶的品质和功效[2]。其中，香气成分对茶的品质和功效起着重要作用，一直是茶叶研究领域的重要课题[3]。目前，已经从茶叶中分离出700余种香气成分，包括醇类、醛类、酮类、酯类、烃类、醚类、酸类和氮氧杂环化合物[4]。“清感饮”系列制剂是张伯礼院士根据多年临证经验及疫情防控经验拟定，具有清喉利咽，疏风解毒的功效，可用于外感风热，咽干舌燥，也有预防季节性流感的作用，主要包括“清感春饮”“清感夏饮”“清感秋饮”“清感冬饮”和“清感童饮”[5]。清感秋饮是以菊花、金银花、紫苏等11味中药为原料，按照一定比例配伍而成的新兴茶饮，气香，味甘，微苦，具有疏风散热，芳香化湿，清喉利咽等功效。目前，对于“清感饮”系列制剂中香气成分药效物质基础研究较少，因此，建立一种快速、准确的分析方法对清感秋饮中的挥发性成分进行全面分析，对其香气成分功效评价提供数据支撑。
顶空-气相色谱-离子迁移谱（HS-GC-IMS）技术是一种基于气相色谱（GC）和离子迁移色谱仪（IMS）联用的新技术。GC通常用于挥发性成分的定性定量分析，IMS由于其高灵敏度，可用于中药材和茶叶中挥发性成分的快速检测[6-10]。HS-GC-IMS技术具有无需样品前处理、高灵敏度、低检出限等优势[11-12]，在茶叶[13-14]、烟草[15]、酒[16-17]、粮食[18-19]等领域具有广泛的应用。HS-GC-IMS技术具有很多优点且应用范围广泛，但是在定性分析方面仍具有一定的局限性，主要是能够捕获和检测10个碳（C10）及以下的小分子挥发性成分。HS-SPME-GC-MS技术具有操作简便、灵敏度高、定性能力强等优点[20]，在茶叶[21-22]、食品[23]、中药[24]等领域的研究中应用广泛。顶空-固相微萃取-气质联用（HS-SPME-GC-MS）技术在挥发性成分的定性上与HS-GC-IMS技术互补，主要是能够捕获和检测C10及以上的大分子挥发性成分。本研究采用HS-GC-IMS和HS-SPME-GC-MS技术联合对清感秋饮中的挥发性成分进行了全面表征，为“清感饮”系列制剂中挥发性成分的全面表征及紫苏属酮、异白苏烯酮、（Z）-乙酸菊酯、β-石竹烯等主要药效成分的鉴定提供参考依据。
1 仪器和材料 1.1 仪器FlavourSpecⓇ气相色谱-离子迁移谱联用仪（山东海能科技仪器有限公司）。石英毛细管柱（FS-SE-54-CB-1，15 m×0.53 mm，0.5 μm）。
7890B-7000D三重四级杆气相色谱质谱联用仪（美国Agilent公司），弹性石英毛细管柱（美国Agilent公司19091S-433 HP-5 ms，30 m×0.25 mm×0.25 μm），自动进样器（德国Gerstel公司），手动固相微萃取进样器、30/50 μm PDMS/CAR/DVB固相微萃取纤维头（美国Supelco公司）。
1.2 材料清感秋饮（批号SJQ32020017）和菊花（批号20201018）购自天津中医药大学附属保康医院，菊花经天津中医药大学张丽娟教授鉴定为菊科植物菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）的干燥头状花序。
2 方法 2.1 样品的制备将清感秋饮和菊花样品碾碎，过40目筛并混合均匀，分别称取约1.0 g碾碎的样品置于20 mL顶空进样瓶中，迅速压紧瓶盖，备用。
2.2 顶空-气相色谱-离子迁移谱分析条件石英毛细管柱（FS-SE-54-CB-1，15 m×0.53 mm，0.5 μm）；柱温：60 ℃；载气：N2（纯度≥99.999 %）；载气流速：0~2 min，2 mL/min；2~10 min，2~10 mL/min；10~20 min，10~100 mL/min；20~30 min，100~150 mL/min。分析时间为50 min，漂移气为N2（纯度≥99.999%），漂移气流量为150 mL/min。漂移管温度为45 ℃，孵化温度为80 ℃，孵化时间为20 min，进样方式为顶空进样，进样体积为500 μL，进样针温度为85 ℃，加热方式为振荡加热，振荡速度为500 r/min，不分流。
以n-酮（C4-C9，国药控股，北京，中国）计算各挥发物的保留指数。组分特征峰对应的保留时间和迁移时间可用于物质定性，检测结果通过内置的NIST气相保留指数数据库与G.A.S的IMS迁移时间数据库二维定性。
2.3 顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱分析条件弹性石英毛细管柱（Agilent 19091S-433 HP-5ms，30 m×0.25 mm×0.25 μm）。色谱分离采用程序升温模式：0~2 min，50 ℃；以10 ℃/min升至70 ℃；以3 ℃/min升至180 ℃；以5 ℃/min升至220 ℃；以10 ℃/min升至230 ℃。孵化温度为80 ℃，孵化时间为20 min，吸附时间为20 min，解吸时间为300 s。进样口温度为250 ℃，载气为高纯氦气（纯度≥ 99.999%），载气流速为1 mL/min，分流比为5∶1。质谱检测器离子源为EI源，电子能量为70 eV，离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，质谱扫描范围为m/z 30~650。
采用以上色谱方法对清感秋饮和菊花进行分析，得到清感秋饮和菊花的总离子流图及质谱数据。通过对比NIST 17标准库的质谱和保留指数（RI）对清感秋饮和菊花中挥发性成分进行定性分析，进一步按照峰面积归一化法计算各挥发性成分的相对百分含量。
3 结果与分析 3.1 顶空-气相色谱-离子迁移谱挥发性成分的分析在图 1中，纵坐标表示保留时间，横坐标表示漂移时间。色谱图中左侧的红色垂直线为归一化反应离子峰（RIP），每一个点代表一种挥发性成分，点的颜色越红，说明信号峰强度越高，所对应的物质浓度就越大，整个光谱代表样品的顶空组成。
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| 图 1 清感秋饮、菊花样品的气相离子迁移谱图 |
挥发性成分大部分位于保留时间为0~1200 s、漂移时间为1.0~2.0 s的区域。经过数据库对比分析，从清感秋饮中共鉴定出41种挥发性成分，41种挥发性成分碳链都在C3-C10以内，包括11种醇类、6种酮类、7种醛类、5种酸类、4种酯类、2种烯类和6种环类挥发性成分（表1）。将清感秋饮和菊花的气相色谱离子迁移指纹图谱分为A、B和C 3个区域。区域A中，已知的挥发性成分有甲基庚烯酮、苯乙酮、2-乙基吡嗪等，这些挥发性成分在清感秋饮中含量很高，但在菊花中含量很低甚至没有，所以推测这些挥发性成分可能来源于清感秋饮中的紫苏叶、金银花、桑叶等。区域B中，已知的挥发性成分有α-蒎烯、桉叶油醇、芳樟醇等，这些挥发性成分在清感秋饮和菊花中含量差别不大，所以推测这些挥发性成分可能来源于清感秋饮中的菊花。区域C中，已知的挥发性成分有乙酸乙酯、苯甲醛、苏合香醇等，这些挥发性成分在菊花中含量较高，而在清感秋饮中含量较低甚至没有，所以推测这些挥发性成分可能是菊花中的主要挥发性成分。气相色谱离子迁移指纹图谱中未识别的挥发性成分用数字表示，见图 2。
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| 图 2 清感秋饮、菊花样品总体气相离子迁移指纹图谱 |
用Masshunter定性分析软件对HS-SPME-GC-MS获取的原始数据进行一系列分析鉴定，HS-SPME-GC-MS谱图如图 3所示。通过与NIST 17质谱库和文献资料共同分析，最终在清感秋饮中共鉴定出85种挥发性成分，包含9类挥发性成分，分别为酮类、烃类、醇类、酯类、环类、醛类、酚类、酸类和醚类挥发性成分，其中80%以上的挥发性成分的碳链在C10及以上。此外，清感秋饮中各挥发性成分的相对含量也以峰面积比的方式列于表2，其中种类最多的为醇类，有26种（含量占13.05%）；烃类次之，有18种（18.15%）；酮类有10种（51.97%）；环类有9种（4.41%）；酯类有8种（6.17%）；种类较少的为醛类（5种）、酚类（4种）、酸类（1种）和醚类（1种）。其中含量较高的挥发性成分为紫苏属酮（30.30%）、异白苏烯酮（10.85%）、3-甲基-6-（1-甲基亚乙基）环己-2-烯-1-酮（5.41%）、β-倍半水芹烯（4.88%）、α-姜黄烯（3.61%）、（Z）-乙酸菊酯（3.42%）和β-石竹烯（2.60%）。以上几种挥发性成分占总挥发性成分的60%以上，可能为清感秋饮中的主要药效成分。
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| 图 3 清感秋饮（A）、菊花（B）样品的HS-SPME-GC-MS谱图 |
本研究采用HS-GC-IMS结合HS-SPME-GC-MS分析方法对清感秋饮中的挥发性成分进行全面定性及定量分析。其中，HS-GC-IMS方法鉴定出41种挥发性成分，HS-SPME-GC-MS方法鉴定出85种挥发性成分，共有6种挥发性成分在两种方法中均被检测出，包括芳樟醇、桉叶油醇、1-辛稀-3-醇、甲基庚烯酮、异戊醛和α-蒎烯。据文献报道[25-27]，芳樟醇、α-蒎烯为金银花和菊花中的主要挥发性成分，具有治疗咽喉肿痛，清热解毒，凉血等功效。一些C2-C8的小分子挥发性成分，如糠醇、苯乙醛、乙酸乙酯等，在HS-SPME-GC-MS中无法检测到，但在HS-GC-IMS中可以检测到，这些差异是由HS-GC-IMS的特性造成的，因为HS-GC-IMS技术主要是能够捕获和检测C10及以下的小分子挥发性成分，而HS-SPME-GC-MS技术主要是能够捕获和检测C10及以上的大分子挥发性成分，所以本研究采用HS-GC-IMS结合HS-SPME-GC-MS方法能够实现对清感秋饮中挥发性成分的全面、准确、快速的表征。
另外，在气相离子迁移谱图中，大多数挥发性成分在进入漂移管之前由于中性质子化成分的电离而呈现二聚体，所以有一些化合物会显示出两个峰。对应于单体和二聚体，二聚体会在单体之后洗脱，因为对于像桉叶油醇、苯乙醛和乙酸乙酯这样的挥发性成分，二聚体的质量更高。此外，笔者的GC×IMS数据库无法识别到目前为止报告的所有标记，今后还需要补充GC×IMS数据库的中药挥发性成分。
清感秋饮等“清感饮”系列制剂能够预防呼吸系统疾病，减轻呼吸系统感染性疾病的症状，预防普通型感冒、流行性感冒、急慢性咽炎等外感风热病症，降低流感和新冠病毒叠加的风险，减少疫情防控的压力和成本[5, 29]。通过HS-SPME-GC-MS分析方法的相对定量表明，清感秋饮中酮类成分（51.97%）含量占有很大比例，其次为烃类（18.15%）、醇类（13.05%）、酯类（6.17%）和环类（4.41%）。其中，紫苏属酮、异白苏烯酮、（Z）-乙酸菊酯、β-石竹烯等可能为清感秋饮中的主要药效成分。据文献报道，紫苏属酮和异白苏烯酮为紫苏叶中的主要挥发性成分，具有治疗风热感冒，止咳平喘，消炎等功效。在表2中列出的各挥发性成分的相对含量可作为辅助信息来解释各挥发性成分对清感秋饮药效的潜在贡献。本研究为“清感饮”系列制剂中挥发性成分的全面表征及香气成分药效评价提供参考依据。
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