葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根^[1]，习称野葛，具有解肌退热，生津止渴，透疹，升阳止泻，通经活络，解酒毒之功效。现代研究表明，葛根中主要功效成分为葛根素、大豆苷元、大豆苷等异黄酮类化合物^[2]。临床研究表明葛根具有保护心脑血管、降低血管阻力、降血糖、血脂及血压、退热等多种功效^[3-4]。

葛根配方颗粒是以单味饮片为原料，水为溶媒，经过煎煮、浓缩、喷雾干燥、干法制粒等工序加工而成^[5-6]，除具有传统汤剂可以随症加减的优势外，还具有免煎煮，方便携带等优点。然而对其本身的研究仍存在一些问题，如目前所报道的文献中，只对葛根饮片、标准汤剂^[7]、配方颗粒^[8]单独进行研究，缺少统一的质量标准及质量控制体系。2016年8月国家药典委员会在“中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（征求意见稿）”中，把标准汤剂作为衡量中药配方颗粒是否与临床汤剂基本一致的标准参照物。因此本研究采用UPLC建立了24批葛根饮片、标准汤剂、配方颗粒的特征图谱和含量测定法，对3者相关性进行研究，不仅可以更好的控制葛根配方颗粒的质量，保证生产工艺的稳定性，也满足葛根配方颗粒与传统汤剂物质成分保持一致的要求，为临床用药提供科学依据。

1 实验材料 1.1 仪器

超高效液相色谱仪（Waters UPLC H-Class）；Waters ACQUITY UPLC^Ⓡ BEH C₁₈，1.7 μm（2.1 mm×100 mm）色谱柱；数据采集处理系统采用Empower3色谱数据工作站；ME104E电子天平（梅特勒·托利多），JY20002电子天平（梅特勒·托利多），BSA124S电子天平（赛多利斯科技仪器（北京）有限公司）；DZKW-4恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司），KQ-500DB超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），LGJ-10F冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）；N-1100旋转蒸发仪、CCA-1112冷却水循环装置、MZ2cNT气动薄膜真空泵（日本东京理化器械株式会社）；微电脑煎药锅；实验室喷雾干燥机YC-015（上海雅程仪器设备有限公司）；干法制粒机LGS120（北京新龙立科技有限公司）。

1.2 试药及试剂

葛根饮片信息（见表 1，编号A1~A24），葛根素对照品（批号：110752-201514，纯度，95.5%，中国食品药品检定研究院）；乙腈（色谱级，Fisher）、磷酸（色谱级，Fisher）、水为屈臣氏蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果 2.1 供试品溶液的制备 2.1.1 葛根标准汤剂的制备

根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（征求意见稿）》的原则制备同批号的葛根标准汤剂，编号为B1~B24，称取葛根饮片200 g，煎煮2次，一煎加入9倍量水，先浸泡30 min，加热沸腾，煎煮30分钟，滤液趁热过滤（150目筛网），二煎加入7倍量水，煎煮20 min，滤液趁热过滤（150目筛网），合并两次滤液，减压浓缩（50 ℃）至料液比为1∶1，冷冻干燥，即得。

2.1.2 葛根配方颗粒的制备

取葛根饮片，加水12倍，煎煮1.5 h，滤液减压浓缩成相对密度为1.10~1.15（60 ℃）的浸膏，干燥，加糊精适量，制成颗粒，包装，即得，编号为C1~C24。

2.1.3 葛根供试品溶液的制备

分别称取24批葛根饮片粉末（过3号筛）0.1 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入30%乙醇100 mL，称定质量，超声处理40 min，放冷，再称定质量，用30%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；分别称取葛根标准汤剂，取约0.1 g，精密称定，按照葛根饮片制备方法制备标准汤剂供试品溶液；分别称取葛根配方颗粒0.1 g，精密称定，按照葛根饮片制备方法制备葛根配方颗粒供试品溶液。

2.2 葛根素对照品溶液的制备

取葛根素对照品适量，精密称定，加30%乙醇制成每1 mL含80 μg的溶液，即得。

2.3 色谱条件

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Waters ACQUITY UPLC^Ⓡ BEH C₁₈（柱长100 mm，柱内径2.1 mm，粒径1.7 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱：0~10 min，6.0%~9.0%A；10~14 min，9.0%~11.0%A；14~22 min，11.0%~30.0%A；检测波长为250 nm；柱温30 ℃；流速0.4 mL/min；进样量0.4 μL。

2.4 方法学研究 2.4.1 线性考察

取葛根素对照品适量，加30%乙醇制成每1 mL含0.385 2 mg的溶液，作为葛根素对照品母液；分别精密吸取葛根素对照品母液0.5、1.0、2、3、4、5 mL，置于10 mL容量瓶中，加30%乙醇至刻度，摇匀，滤过，即得。按2.3中方法测定葛根素色谱峰峰面积，以葛根素色谱峰的峰面积为纵坐标，葛根素的浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为y=3 914 480.11x-2 080.91，R²=1.0。实验表明，葛根素浓度在0.019 2~0.191 6 mg/mL范围内，线性关系良好。结果见表 2。

2.4.2 精密度实验

取2.1.3项下制备的供试品溶液，按照2.3色谱条件进样，连续6次，结果平均峰面积为366 897.8，计算RSD%为0.7%，表明仪器精密度良好，结果见表 3。

2.4.3 稳定性实验

按照2.1.3项下方法制备供试品溶液，按照2.3色谱条件进样，分别于配制后0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，测定并计算葛根素峰平均峰面积为362 474.9，计算RSD%为1.1%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好，结果见表 4。

2.4.4 重复性实验

取同一批次样品，按照2.1.3项下方法制备6份供试品溶液，按照2.3色谱条件进样，测定并计算葛根素平均含量为9.1%，RSD%为0.5%，实验表明本方法重复性良好，结果见表 5。

2.4.5 加样回收实验

取葛根素对照品适量，精密称定，加30%乙醇制成每1 mL含53.12 μg的溶液。取2.1.1项下制备的样品6份，每份约0.025 g，精密称定，精密加入葛根素对照品溶液50 mL（2.656 mg葛根素），余下操作同2.1.3项下方法，并按2.3项色谱条件进样，测定并计算加样回收结果，平均回收率为97.4%，RSD%为2.0%，结果见表 6。

2.4.6 样品含量测定

按照2.3项下的色谱条件进样，测定葛根饮片、标准汤剂、配方颗粒中葛根素的含量，同时计算24批饮片到标准汤剂、饮片到配方颗粒葛根素的转移率（转移率=制剂中葛根素含量*岀膏率/饮片中葛根素含量），结果见表 7。根据数据结果可知，葛根标准汤剂中葛根素的平均转移率为50.3%，葛根配方颗粒中葛根素的平均转移率为39.1%，表明本研究的配方颗粒制备工艺基本稳定，满足生产要求。

2.5 葛根特征图谱共有模式建立 2.5.1 对照品溶液的制备

制备方法同“2.2”项下制备过程。

2.5.2 供试品溶液的制备

按“2.1.3”项供试品溶液制备方法制备葛根饮片、葛根标准汤剂、葛根配方颗粒供试品溶液。

2.5.3 精密度实验

取“2.1.3”项下的供试品溶液（编号C1），按照“2.3”项下的色谱条件连续进样6次，记录各峰面积。计算各共有峰相对峰面积（相对葛根素峰的峰面积，下同）的RSD均在1.5%以内，表明仪器的精密度良好，满足分析要求。

2.5.4 重复性实验

取同一批次葛根配方颗粒（编号C1），按照“2.1.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.3”项下色谱条件进行测定，记录色谱结果。计算得各共有峰相对峰面积RSD均在2.0%以内，表明该方法重复性较好。

2.5.5 稳定性实验

取“2.1.3”项下同一供试品溶液（编号C1），按照“2.3”项下的色谱条件分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样分析，记录色谱结果。计算得各共有峰相对峰面积RSD均在3.0%以内，表明供试品溶液在24 h以内稳定性良好。

2.5.6 样品特征图谱测定及相关性分析

按照2.3项色谱条件，建立24批葛根饮片（图 1）、标准汤剂（图 2）、配方颗粒（图 3）UPLC特征图谱，并采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版）生成其对照特征图谱，对饮片、标准汤剂、配方颗粒中的共有峰进行标识，确定共有峰有8个，可以作为葛根特征图谱的特征峰。葛根饮片、标准汤剂、配方颗粒对照特征图谱相似度结果（见图 4、表 8），均在0.90以上，说明葛根饮片中的物质成分均能在标准汤剂、配方颗粒中实现转移，为葛根配方颗粒与传统汤剂物质基础一致及葛根配方颗粒生产过程质量控制提供可行性参考。

3 讨论

本研究综合考察了乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸溶液，甲醇-水，甲醇-0.1%磷酸溶液等几种流动相体系，结果显示以乙腈-0.1%磷酸溶液的流动相体系基线更平稳，色谱峰的分离度更好；考察了不同型号品牌的色谱柱，所呈现的色谱峰数相同，但保留时间相差很大，BEH C₁₈柱出峰时间相对较快，根据分离效果及峰型比较后，最终选择BEH C₁₈色谱柱作为葛根特征图谱的色谱柱型号。

2020版《中国药典》中仍以葛根素含量作为评价葛根药材质量的重要指标之一，而葛根素作为葛根中主要的药效成分，对其含量的控制可以为临床安全用量提供依据。本研究采用UPLC对葛根饮片、标准汤剂、配方颗粒均进行了指标成分葛根素的含量测定和特征图谱研究。通过对葛根饮片、标准汤剂、配方颗粒的特征图谱分析，共确定了8个共有的特征峰，并且葛根饮片、标准汤剂、配方颗粒对照特征图谱相似度分别大于0.90，相似度较高，表明葛根从饮片、标准汤剂到配方颗粒制备，其物质成分基本一致，三者特征图谱相关性较好，为葛根配方颗粒代替传统汤剂提供可行性参考；此外，本研究通过含量测定分析，24批葛根标准汤剂中葛根素的平均转移率为50.3%，葛根配方颗粒中葛根素的平均转移率为39.1%。基于定量指标，结合特征图谱可以为葛根配方颗粒的过程质量控制提供更科学的依据。