恶性腹水是肿瘤晚期患者常见并发症，多见于肺癌、乳腺癌、卵巢癌等。腹腔穿刺引流、利尿剂等方法可暂时缓解患者腹胀、腹痛、呼吸困难等症状^[1]，但对控制恶性腹水的进展疗效不佳。中药防治肿瘤历史悠久，且具有提高生活质量、毒副反应小、成本低等优势，从传统中药入手不失为一个新的突破口^[2]。前期研究表明，扶正散结方可以提高荷瘤小鼠的抑瘤率及免疫功能^[3-4]。本研究旨在探讨扶正散结方联合顺铂对H22腹水瘤小鼠的治疗效果及免疫调节功能的影响。

1 材料与方法 1.1 动物与细胞

实验动物选取SPF级昆明小鼠40只，均为雌性，6~8周龄，体质量18~22 g，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司。动物资格许可证号：SCXK（京）2019-0010。肿瘤细胞由H22腹水型肝癌荷瘤小鼠腹水分离而来。

1.2 药物

扶正散结方由黄芪、当归、冬虫夏草、白花蛇舌草、龟板、鳖甲组成。处方药材均购自天津市医药公司，经天津中医药大学张建岭教授鉴定，符合《中华人民共和国药典》2010年版标准。顺铂，齐鲁制药有限公司产品，批号：0F0156B02，溶于200 mL生理盐水，制成0.5 g/L溶液，避光保存。

1.3 扶正散结方制剂制备

按固定比例称取药物，碾碎后用95%乙醇浸泡48 h，取出晾干后放入60 ℃恒温干燥箱烤12 h，粉碎机粉碎后过60目筛网，得干燥药物粉末。然后用8倍量蒸馏水进行热回流提取2次，每次5 h，过滤，药渣再用95%乙醇进行热回流提取2 h，自然冷却后，将乙醇水溶液倒出，过滤药渣，与水提物合并进行真空减压浓缩干燥得到制备样品，并制备成合剂，浓缩至2 g/mL，于4 ℃冰箱贮存备用。

1.4 小鼠腹水瘤模型制备

取稳定传代至第7代的肝癌H22腹水瘤小鼠，无菌抽取腹水6 mL，离心并用生理盐水稀释，调节腹水细胞悬液浓度为2×10⁷个/mL，无菌条件下向小鼠腹腔注射0.2 mL（约含H22细胞4×10⁶个）。接种后观察腹部膨胀程度，注射后约5 d小鼠出现腹部鼓胀，B超检查可见液体暗区，提示腹水形成，腹水模型构建成功。

1.5 分组与给药

将40只小鼠随机分为空白对照组、荷瘤对照组、顺铂组、中药联合顺铂组，每组10只。除空白对照组外，其余小鼠均于第0天制作腹水瘤模型。5 d后观察小鼠出现腹水情况，第6天开始药物干预，给药量和给药方法根据“人和动物间体表面积折算的等效剂量比率表”计算得出。空白对照组：生理盐水0.4 mL灌胃，每日1次；荷瘤对照组：生理盐水0.4 mL灌胃，每日1次；顺铂组：一次性腹腔注射顺铂溶液0.2 mL（5 mg/kg），每周3次；中药联合顺铂组：予扶正散结方药0.4 mL（2 g/mL）灌胃，每日1次，同时腹腔注射顺铂溶液0.2 mL（5 mg/kg），每周3次。2周后，采血并处死小鼠。

2 实验观察指标 2.1 小鼠生存状态

每日观察各组小鼠的体态、活跃程度、饮食、毛色等变化。

2.2 小鼠体质量及腹围测量

每日称量小鼠体质量，测量小鼠腹围。将小鼠水平仰卧位固定放置，测量其髋关节上侧腹部最膨隆部位圆周长，记录体质量及腹围值，绘制小鼠平均体质量、腹围变化曲线。

2.3 瘤块质量及抑瘤率的测定

末次给药24 h后，取小鼠眼球血备用，后脱颈椎处死小鼠，迅速剥取瘤块标本，称取质量，计算抑瘤率。肿瘤抑制率=（1-药物干预组肿瘤平均质量/荷瘤对照组肿瘤平均质量）×100%。

2.4 小鼠脏器质量测量

处死小鼠后，迅速剥取心脏、胸腺、脾脏、肝脏、肾脏，称量其净质量。分别根据脾脏及胸腺质量与体质量之比，计算脾脏指数及胸腺指数。

2.5 血清TNF-α、IFN-γ和IL-2水平测定

每只取眼球血0.5 mL，EDTA-K2抗凝，置离心机中以3 000 r/min离心20 min（离心半径10 cm），收集上层血清，按ELISA操作试剂盒说明测定血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-2（IL-2）水平。

2.6 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行数据分析，所有数据均进行正态性和方差齐性检验，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 各组小鼠生存状态比较

接种后第5日，除空白对照组外，其余各组小鼠均出现腹水，荷瘤组与顺铂组逐渐出现毛发稀疏、色暗无光、行动迟缓和进食量减少等现象。中药联合顺铂组小鼠表现为毛亮牢固，活动基本正常。

3.2 小鼠体质量及腹围测量

与空白对照组比较，荷瘤对照组小鼠体质量增长迅速；与荷瘤对照组比较，顺铂组小鼠注射顺铂后体质量下降明显（P < 0.05）；与顺铂组比较，中药联合顺铂组小鼠体质量下降幅度小（P < 0.05），体质量恢复能力较强，见图 1。

与空白对照组比较，荷瘤对照组小鼠于第6天腹围开始迅速增长（P < 0.05）。与荷瘤对照组比较，顺铂组、中药联合顺铂组小鼠均可减缓腹围增长趋势（P < 0.05），见图 2。

3.3 各组小鼠瘤块质量与抑瘤率比较

顺铂组、中药联合顺铂组均有抑瘤作用，各组平均瘤块质量比较结果为荷瘤对照组 > 顺铂组 > 中药联合顺铂组，抑瘤率表现相反趋势，且中药联合顺铂组的抑瘤率优于顺铂组（P < 0.05），提示扶正散结方具有软坚散结之效，在减轻瘤块质量、提高抑瘤率方面起着积极作用。见表 1。

3.4 各组小鼠各脏器质量变化情况

与空白对照组比较，各组荷瘤小鼠心脏、脾脏、肝脏、肾脏质量未发生明显改变，胸腺质量减轻（P < 0.05）。与顺铂组比较，中药联合顺铂组小鼠胸腺质量增加（P < 0.05），提示荷瘤小鼠的免疫功能在扶正散结方的干预下有了一定改善。见表 2。

3.5 各组小鼠血清TNF-α、IFN-γ和IL-2水平比较

荷瘤对照组小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-2含量均较空白对照组低，差异有统计学意义（P < 0.05）。与顺铂组比较，中药联合顺铂组小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-2水平升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 3。

4 讨论

恶性腹水是肿瘤晚期常见并发症，严重影响患者生存质量。中医将恶性腹水归于“鼓胀”范畴，病机为正气亏虚，邪毒犯肺，肺失宣降，气机不畅，气滞血瘀痰凝，阻塞脉络，肺、脾、肾通调运化、开合失司，三焦气化失宣，痰浊积聚而为饮，津液不布而成腹水。古代医籍中多用攻邪逐水法治疗，而肿瘤患者多本虚标实，应扶正祛邪以逐水。扶正散结方是基于“养正积自消”治疗原则下的自拟方剂，治以消癥化积、和解表里、行气活血。扶正散结方中黄芪补气健脾为君药；当归补血活血，冬虫夏草补肾益肺共为臣药；白花蛇舌草清热解毒为佐药；鳖甲、龟板善治开阖失常之病为使药，均有软坚散结、补肾滋阴之效。前期研究提示扶正散结方具有抑瘤、增效减毒作用^[3-4]。现代药理学研究表明，黄芪水煎提取物、白花蛇舌草均能提高IL-2水平，提高自然杀伤细胞（NK细胞）活性及杀伤肿瘤细胞的能力，增强机体免疫功能进而发挥抗肿瘤作用^[5-10]。

恶性腹水的发生发展与机体免疫功能密切相关，本次实验结果表明：腹水瘤小鼠建模5 d后，腹围及体质量迅速增长，中药联合顺铂组较顺铂组腹围及体质量增长缓慢；各组小鼠生存状态比较，中药联合顺铂组毛亮牢固，活动基本正常，提示此方可改善小鼠的生活状态，对控制小鼠体质量、腹围有着良好的治疗效果；同荷瘤对照组相比，顺铂组、中药联合顺铂组对瘤体生长均有抑制作用，且中药联合顺铂组抑瘤作用优于顺铂组，差异有统计学意义，提示扶正散结方有软坚散结之效，在缩小瘤体、提高抑瘤率方面起着积极作用；称量各脏器净质量发现，各组小鼠心脏、脾脏、肝脏、肾脏净质量比较未见明显差异，各组荷瘤小鼠体质量减轻，中药联合顺铂组小鼠胸腺质量增加，提示此方对免疫器官具有调节作用，脾脏的质量变化不明显，有待扩大实验开展进一步研究。

现代免疫学研究表明，在肿瘤免疫微环境的正性调控中，TNF-α、IFN-γ和IL-2等免疫因子水平与机体免疫能力关系密切。TNF、IL-2等分子通过炎性反应，使血管通透性增强，TNF-α、IL-2通过高渗性血管进入腹腔，使肿瘤患者恶性腹水中TNF-α及IL-2水平异常增高。IL-2可以诱导NK细胞和T细胞产生IFN-γ^[11]，促进辅助性T细胞（Th1细胞）增殖，提高NK细胞的细胞毒作用，促进细胞毒性T细胞（CTL细胞）的形成^[12]。CTL细胞分泌TNF-α、IFN-γ等细胞因子参与免疫调节^[13]，TNF-α能在不损伤正常细胞前提下，直接杀伤肿瘤细胞，还可以通过刺激T淋巴细胞产生抗体和细胞因子，发挥诱导肿瘤细胞凋亡的作用^[14]。作为机体抗肿瘤第1道防线的NK细胞被IL-2、IFN-γ等细胞因子活化后，其抗病毒与抗肿瘤作用显著提高。本次实验结果表明，荷瘤对照组小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-2含量均较空白对照组低，中药联合顺铂组较顺铂组TNF-α、IFN-γ、IL-2水平升高（P < 0.05），提示扶正散结方联合顺铂可以提高小鼠血清TNF-α、IFN-γ和IL-2水平，促进肿瘤免疫微环境的正性调控，有助于提高免疫功能以实现抗肿瘤的目的。

综上所述，扶正散结方能够减少肝癌H22腹水瘤小鼠的腹水量，通过上调血清中TNF-α、IFN-γ、IL-2水平来促进肿瘤免疫微环境的正性调控，提高小鼠的免疫功能，有效抑制肿瘤生长。