高尿酸血症（HUA）是机体尿酸分泌过多或尿酸排泄障碍引起的代谢性疾病，近年来发病率显著升高，危害居民身体健康^[1]。目前，国内常用的降尿酸药物包括抑制尿酸合成（别嘌醇和非布司他）和促进尿酸排泄（苯溴马隆）两类^[1]。西药治疗HUA需长期服药，停药易复发，长期使用存在肝肾毒性^[2]。中医药强调整体观念与辨证论治，治疗HUA有着悠久的历史，具有安全、不良反应少的特点^[3]。因此，寻找具有降尿酸作用的天然中药植物已成为当前医学研究热点之一。

白子菜Gynura divaricata（L.）DC.为菊科三七属植物，具有清热解毒、舒筋接骨等功效，属于药食同源植物^[4-7]。白子菜含有丰富的生物化学活性成分，如多糖、黄酮、生物碱、蒽醌等^[7-9]，具有抗炎、保肝、降血脂等药理活性^[10-12]。目前，暂无文献对白子菜降尿酸作用进行报道。文献资料表明，黄酮类物质治疗HUA具有良好的临床效果^[13]。本课题组前期实验结果初步表明白子菜醇提物具有较明显的降尿酸作用，结合文献资料推测，白子菜总黄酮类成分可能是其治疗HUA的物质基础之一^[14]。本实验基于前期研究成果，拟考察白子菜总黄酮纯化物对HUA大鼠的降尿酸效果，为进一步筛选出白子菜中具有降尿酸作用的化学活性成分提供数据支撑。

1 实验材料 1.1 实验动物

SPF级雄性Wistar大鼠，体质量（200±10）g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，质量检测单位苏州西山生物技术有限公司，动物生产许可证号SCXK（京）2019-0010。

1.2 药品与试剂

白子菜地上部分（2019年11月采于天津种质资源圃）；ZTC1+1 Ⅱ型天然澄清剂（武汉正天成生物科技有限公司）；氧嗪酸钾（批号：B31M9D62661）、次黄嘌呤（批号：Y15J9C52922），均购自上海源叶生物科技有限公司；别嘌醇片（0.1 g/片，批号：20190701，广东彼迪药业有限公司）；4%组织细胞固定液（批号：20201030，北京索莱宝科技有限公司）；尿酸（BUA）试剂盒（批号：20201112）、尿素氮（BUN）测试盒（批号：0201230）、肌酐（SCr）测定试剂盒（批号：20210105）、腺苷脱氨酶（ADA）测试盒（批号：20201220）、黄嘌呤氧化酶（XOD）试剂盒（批号：20201117）购自南京建成生物工程研究所。

1.3 仪器

FA2004型电子天平（上海梅特勒-托利多仪器公司）；UV-6100 PCS型紫外分光光度计（上海美普达仪器有限公司）；HH-ZK4型二列四孔智能水浴锅（巩义市仪器有限责任公司）；SB25-12DTD型超声波清洗机（宁波新艺生物科技有限公司）；DG-203型电热恒温鼓风干燥箱（天津市天宇实验仪器有限公司）；GM-0.33A隔膜真空泵（天津市津腾实验设备有限公司）；DZTW型调温电热套（北京市光明医疗仪器有限公司）；LEICA TP 1020病理脱水机[徕卡显微系统（上海）有限公司]；HistoCoreMULTICUT病理切片机[徕卡显微系统（上海）有限公司]；ES500-1病理包埋机（金华市华速科技有限公司）；ES500-3H病理摊片机（金华市华速科技有限公司）；ES500-2C型冻台（金华市华速科技有限公司）；BPG-9106A型烤箱（上海一恒）；OLYMPUS CKX43光学显微镜（奥林巴斯株式会社）；TGL-16M型医用离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；Spark型多功能酶标仪（瑞士TECAN集团公司）；SCIENTZ-Ⅱ超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

2 实验方法 2.1 药物配制 2.1.1 0.8%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）混悬液的配制

精密称取2.400 gCMC-Na粉末，将其缓慢倒入盛有300 mL蒸馏水的烧杯中，边倒边搅拌，使其均匀分散于蒸馏水中。静置溶胀12 h后，3层纱布过滤，即得0.8%CMC-Na混悬液。

2.1.2 造模剂的配制

精密称取6.000 0 g氧嗪酸钾粉末与6.000 0 g次黄嘌呤粉末，置于研钵中，充分研磨至分散均匀。将50 mL 0.8%CMC-Na混悬液分次加入研钵，使药物粉末与CMC-Na混悬液充分混匀，即得造模剂（氧嗪酸钾120 g/mL，次黄嘌呤120 g/mL的混悬液）。

2.1.3 别嘌醇混悬液的配制

精密称取别嘌醇粉末0.420 0 g，置于研钵中。准确量取90 mL 0.8%CMC-Na混悬液，分次加入研钵中，研磨，使别嘌醇均匀分散于CMC-Na混悬液中，即得别嘌醇混悬液（含别嘌醇4.67 mg/mL的混悬液）。

2.1.4 白子菜总黄酮纯化物的制备

白子菜干燥地上部分采收后，于阴凉通风处干燥，粉碎，过筛，得白子菜粗粉。取150 g白子菜粗粉，加入3 L 60%乙醇回流提取，共提取两次。合并滤液，回收溶剂，得250 mL白子菜提取液。将白子菜提取液置于50 ℃水浴中，加入ZTC1+1 Ⅱ型天然澄清剂B组分10 mL与A组分5 mL进行澄清处理。澄清结束后，室温静置2 h，3 000 r/min离心5 min，取上清液，即得白子菜澄清液。将白子菜澄清液以大孔吸附树脂洗脱，收集洗脱液。将洗脱液水浴蒸发，待蒸发至无液体流动时，将蒸发皿置于105 ℃烘箱挥干溶剂，即得白子菜总黄酮纯化物（纯度70.63%）。

2.1.5 白子菜总黄酮纯化物混悬液的配制

分别取2、4、8 g白子菜总黄酮纯化物粉末，置于研钵中。分别准确称量50 mL 0.8%CMC-Na混悬液，分次加入研钵，使药物粉末与混悬液充分混匀，即得不同浓度的白子菜总黄酮纯化物混悬液（分别含白子菜总黄酮14、28、56 mg/mL）。

2.2 动物分组与饲养

将60只大鼠随机分为空白组、模型组、别嘌醇组、白子菜总黄酮低剂量组、白子菜总黄酮中剂量组、白子菜总黄酮高剂量组，每组10只。大鼠饲养于天津中医药大学动物中心动物屏障系统，温度20~26 ℃，相对湿度40%~70%，通风次数10~15次/h，全新风，光照12 h明、12 h暗。各组大鼠均自由饮食。

2.3 动物干预及日常状态观察

本实验根据参考文献^[15-16]与课题组前期实验，采用氧嗪酸钾-次黄嘌呤联合造模，以模型组BUA显著升高（P＜0.05）作为造模成功的依据。除空白组外，其余组每日灌胃给予造模剂（2.5 mL/kg），空白组灌胃给予0.8%CMC-Na混悬液（2.5 mL/kg）。依预实验结果确定给药剂量。造模1 h后，白子菜总黄酮低剂量组、中剂量组、高剂量组分别灌胃给予不同浓度的白子菜总黄酮纯化物混悬液（3.21 mL/kg），阳性组灌胃给予别嘌醇混悬液（5.43 mL/kg），空白组给予0.8%CMC-Na混悬液（3.2 mL/kg）。各组大鼠均饮用洁净无菌的纯净水，每日称量大鼠体质量，记录各组食量。

2.4 取材

给药第7天，给予造模剂2 h后开始取材。将大鼠麻醉后，腹主动脉取血处死动物。取大鼠左肾，观察外观性状。将大鼠左肾置于4%组织细胞固定液中储存。剪取大鼠肝脏，立即置于液氮中冷冻保存。

2.5 大鼠血液生化指标检测

大鼠腹主动脉取血后，将血液样本静置1 h后离心，分离血清，4℃冷藏备用。按照试剂盒使用说明，依次检测大鼠BUA、SCr、BUN含量与ADA活性。

2.6 大鼠肝脏XOD活性检测

准确称取大鼠肝脏，按照质量（g）∶体积（mL）=1∶9的比例加入9倍体积的0.9%生理盐水。冰水浴条件下，使用细胞破碎仪机械匀浆，制成大鼠肝脏组织匀浆液，离心半径87 mm，3 000 r/min，温度4 ℃，离心10 min，准确移取上清液，依据试剂盒说明，检测大鼠肝脏XOD的活性。

2.7 大鼠肾脏组织病理形态观察

将大鼠左肾进行脱水、包埋、制片、切片处理，经苏木精-伊红（HE）染色处理后，在光学显微镜下使用NIKON digital sight DS-FI2成像系统观察并描述，图像标尺为100 μm。

2.8 数据处理

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，数据以均数±标准差（x±s）表示。当数据符合正态性且方差齐时，采用单因素方差分析进行比较；当数据不符合正态性和方差齐时，采用非参数检验进行分析，以P < 0.05表示差异有统计学意义。

3 结果与分析 3.1 大鼠一般状态观察

干预期间各组大鼠每日食量与体质量变化见图 1、图 2。空白对照组大鼠的食量均匀增加，处于正常生长发育阶段。与空白组相比，模型组大鼠食量与体质量无显著差异。别嘌醇组大鼠食量处于较低水平，与之相对应的，该组大鼠体质量呈下降趋势，整体低于其余各组，推测阳性对照药别嘌醇对大鼠食欲有抑制作用，可能阻碍大鼠正常生长发育。白子菜总黄酮低剂量组大鼠食量短暂降低后回升，中剂量组、高剂量组食量与体质量和空白组比无显著差异。

观察大鼠状态发现，除空白对照组外，其余各组大鼠均有毛发脱落现象，别嘌醇组大鼠毛发脱落现象最明显；与其他各组相比，别嘌醇组大鼠饮水量极少，体质量下降显著，反应迟钝。与空白对照组比较，别嘌醇组大鼠二便明显异常，尿液颜色为深黄色，粪便黄色，水样腹泻。推测阳性药别嘌醇对大鼠消化系统有副作用。

3.2 白子菜总黄酮对大鼠BUA的影响

白子菜总黄酮对大鼠BUA的影响如图 3所示。与空白对照组相比，模型组的BUA含量显著升高，达空白组含量的近4倍，表明大鼠急性HUA模型建立成功。别嘌醇组的BUA含量显著低于空白对照组（P＜0.05），提示别嘌醇有较强的降尿酸作用。白子菜总黄酮各给药组的BUA含量均显著低于模型组（P＜0.05）。与模型组比较，白子菜总黄酮低剂量组的大鼠BUA降幅为24.38%，白子菜总黄酮中剂量组的大鼠BUA降幅为42.71%，白子菜总黄酮高剂量组的大鼠BUA降幅为42.09%，与白子菜总黄酮中剂量组相比无显著性差异。

3.3 白子菜总黄酮对大鼠BUN的影响

白子菜总黄酮对大鼠BUN的影响如图 4所示。与空白组相比，其余各组大鼠血清BUN含量显著上升。白子菜总黄酮各给药组BUN含量均显著低于模型组（P＜0.05），随白子菜总黄酮给药剂量增加，BUN水平呈下降趋势。由结果可知，别嘌醇组和急性HUA模型组大鼠的肾脏功能存在衰竭现象，而白子菜总黄酮给药组均可显著降低BUN水平（P＜0.05），白子菜总黄酮在急性HUA模型中可保护大鼠肾功能。

3.4 白子菜总黄酮对大鼠SCr的影响

白子菜总黄酮对大鼠SCr的影响如图 5所示。与空白组相比，模型组、别嘌醇组大鼠SCr含量显著升高。与模型组相比，白子菜总黄酮各给药组均可显著降低SCr含量，但不存在明显量效关系。

3.5 白子菜总黄酮对大鼠ADA的影响

白子菜总黄酮对大鼠ADA的影响如图 6所示。与空白组相比，模型组与别嘌醇组ADA活性显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，白子菜总黄酮低剂量组、白子菜总黄酮中剂量组ADA活性显著下降（P＜0.05）。推测适宜剂量的白子菜总黄酮有保肝的作用。

3.6 白子菜总黄酮对大鼠肝脏XOD活性的影响

白子菜总黄酮对大鼠肝脏XOD活性的影响如图 7所示。与空白组相比，模型组XOD活性显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，别嘌醇组、白子菜总黄酮各给药组肝脏XOD活性均显著下降（P＜0.05）。由此推测，白子菜总黄酮可抑制XOD活性，减少体内尿酸的生成。

3.7 大鼠肾脏组织病理形态观察

观察大鼠干预后肾脏HE染色结果，与空白对照组相比，各组大鼠的肾脏组织结构与形态均有不同程度的改变。图 8-（a）表明：空白组大鼠的肾组织结构完整，肾小球形态正常，间隔均匀，肾间质含量丰富。由图 8-（b）可知：模型组大鼠的肾小管结构紊乱肿胀，肾小球硬化固缩损伤明显，形态受损，硬化固缩基底膜增厚，肾小管上皮细胞呈现明显的水肿现象，出现炎性细胞浸润，显示造模药物对大鼠肾脏损害程度较高。别嘌醇组大鼠的肾小球肾小管形态正常，结构完整，但出现少量炎症细胞浸润，结果见8-（c）。图 8-（d）、8-（e）表明，在白子菜总黄酮治疗组中，低剂量组、中剂量组大鼠的肾小管结构紊乱肿胀明显，肾小球硬化出现固缩损伤。高剂量组大鼠的肾小管、肾小球结构基本正常，结果见图 8-（f）。上述结果表明，高剂量的白子菜总黄酮有一定保护肾脏作用。

4 讨论与结论

HUA是一种代谢性疾病^[17]，临床上有多种治疗手段。与西药相比，中药在HUA的治疗中具有安全性高、效果显著的特点^[18]。因此，开发降尿酸药用植物成为寻找HUA治疗方案的良好方向。白子菜Gynura divaricata（L.）DC.为菊科多年生草本植物，可改善改善血脂紊乱^[6]，降低空腹血糖^[5]。治疗HUA的药物筛选研究常采用啮齿类动物作为模型动物^[19]。与人类不同，啮齿类动物体内含有尿酸酶，可使尿酸氧化为尿囊素排出体外^[20-21]。别嘌醇是黄嘌呤氧化酶抑制剂的一种，在HUA的临床治疗上有广泛的应用^[22]。本实验从尿酸生成角度出发，采用氧嗪酸钾与次黄嘌呤联合造模，以别嘌醇作为阳性对照药物，探究白子菜总黄酮纯化物的降尿酸效果。造模7 d后，模型组BUA含量达空白组的4倍，同时发现：SCr、BUN含量、ADA、XOD活性均显著升高（P＜0.05），并出现肾脏损伤。由此可知，该造模方法可有效建立大鼠急性HUA模型。

饲养过程中发现，别嘌醇组大鼠出现脱毛、纳呆与便溏的现象，体质量大幅度下降。SCr和BUN可反映肾脏功能损伤与否。从生化指标上看，与空白组和模型组相比，别嘌醇组大鼠SCr、BUN含量显著升高（P＜0.05）；基于肾脏组织形态学观察可知，别嘌醇组大鼠肾脏出现明显的炎症细胞浸润现象，表明别嘌醇对肾脏有一定的副作用。ADA是评价肝功能的指标，其活性的异常上升代表肝功能受到损伤。与空白组相比，别嘌醇组大鼠ADA活性显著升高（P＜0.05），推测别嘌醇可造成肝损伤。上述结果表明，阳性药别嘌醇可显著降低大鼠尿酸水平，但对肝肾有毒副作用。

与模型组相比，白子菜总黄酮各给药组大鼠BUA显著降低（P＜0.05），降尿酸效果显著。白子菜总黄酮中剂量组与白子菜总黄酮高剂量组尿酸水平无显著差异，中剂量的白子菜总黄酮（90 mg/kg）可起到优良的降尿酸效果。与此同时，与模型组相比，白子菜总黄酮各给药组SCr、BUN显著降低（P＜0.05），白子菜总黄酮高剂量组肾脏组织形态学损伤程度显著减轻，提示白子菜总黄酮可一定程度的减缓HUA模型建立时造成的肾脏损伤。与模型组相比，白子菜总黄酮各给药组ADA活性显著下降（P＜0.05），说明白子菜总黄酮有保护肝脏的作用。与模型组相比，白子菜总黄酮各给药组XOD活性显著下降（P＜0.05），推测抑制尿酸生成可能是白子菜总黄酮降尿酸的机制之一。由结果可知，白子菜总黄酮不但有显著的降尿酸效果且具有一定的保肝、护肾作用。