中医药是起源于中国，具有悠久历史和完整理论及技术方法的医药学体系。几千年来，在中医理论的指导下，中药广泛应用于疾病的预防、诊断和治疗，并且其治未病和大健康的理念越来越被现代医学所接受。由于中药基质复杂，很多成分化学结构相似、极性差异较小，难以实现色谱分离。随着分析技术的不断发展，二维液相色谱（2D-LC）技术的出现使中药组成成分的研究取得了显著进展。相比于传统的一维液相色谱，2D-LC具有更好的峰容量和分离度，对于基质复杂的中药及复方制剂具有更强的分析能力，已经成为研究中药成分常用的1种分析技术^[1-5]。

2D-LC分为离线二维液相色谱和在线二维液相色谱两种模式，在线二维液相色谱又分为中心切割二维液相色谱和全二维液相色谱^[6]。本文介绍二维液相色谱技术的概念、特点和分离优势，并对其在中药研究中的应用进行了综述，为该技术在中药化学成分表征、系统分离、质量控制、活性成分筛选等方面的应用提供一定参考。

1 二维液相色谱概念

2D-LC是将分离机制不同而又相互独立的两根色谱柱串联起来构成的分离系统。样品先经过第一维色谱柱进行分离，再经收集、浓缩或切割后进入第二维色谱柱及检测器中。评价二维液相色谱系统的指标主要是正交性和峰容量。二维色谱之间的正交性是影响二维液相色谱分离的关键因素^[7]。提高正交性的方法可以通过改变色谱条件中的固定相、流动相和柱温等因素来实现，其中对二维液相色谱正交性影响最大的是色谱柱的选择。第一维色谱柱和第二维色谱柱的保留机制之间的相关性越小，正交性越高。因此，选择不同分离机制的色谱柱已成为构建二维液相色谱系统的研究重点。基于不同的分离目的，可以将不同分离机制的固定相构建二维液相色谱系统，反相色谱（RPLC）、正相色谱（NPLC）、亲水作用色谱（HILIC）、离子交换色谱（IEC）、分子排阻色谱（SEC）和亲和色谱（AC）等分离模式均可以两两组合运用于特定目的的分离^[8-9]。峰容量是指在一定时间内，经过色谱柱洗脱达到一定分离度的色谱峰最大数量。当第一维色谱和第二维色谱的分离完全正交时，二维液相色谱系统的理论峰容量为两个维度峰容量的乘积。但二维液相色谱系统的实际峰容量往往低于理论峰容量，主要原因是第一维色谱和第二维色谱的分离模式难以达到完全正交^[10]。

2 二维液相色谱的分离模式

2D-LC根据第一维馏分转移到第二维的方式可分为离线模式和在线模式，图 1所示为离线二维液相色谱与在线二维液相色谱工作流程图。离线二维液相色谱没有流动相兼容的问题，因为第一维馏分在注入第二维液相之前会经过浓缩和重新溶解，更适合于中药中化合物的分离与纯化^[11-12]。与离线模式相比，在线二维液相色谱在技术上具有更大的挑战性，但由于其较高的可重复性和自动化程度，能够避免人为误差，适用于高通量分析，在线二维液相色谱更适合复杂中药中未知成分的鉴定与表征^[13-14]。此外，根据第一维馏分是否完全转移到第二维液相，将在线二维液相色谱分为全二维液相色谱（LC×LC）和中心切割二维液相色谱（LC-LC）^[5]。二维液相色谱分类如图 2所示。LC×LC是将一维系统中的所有组分全部转入到二维色谱中。LC-LC根据将一个或者多个组分转入到第二维液相色谱，又可分为单中心切割及多中心切割。在本节中，对每种模式的优缺点进行了阐述，表 1对二维液相色谱各模式特点及适用范围进行了总结。

2.1 离线模式

在离线模式下，将样品注入独立的第一维液相色谱系统，手动收集第一维馏分并对其浓缩，然后将收集的馏分重新溶解后，注入与第一维分离机制不同的第二维液相色谱系统。与在线二维液相色谱相比，离线模式下不需要在第二维系统中实现快速分离，因此具有更高的峰容量，但是在馏分的收集和处理上花费的时间相对更多。另外，离线模式对仪器的要求较低，每一维色谱系统可以独立存在，因此不会受到溶剂不兼容的影响^[15-19]。综上所述，离线模式具有仪器操作简单、溶剂选择范围广、每一维色谱条件可以进行独立优化等优点，缺点是样品处理过程复杂，收集后的组分大多需要富集浓缩，容易造成样品的损失和污染，自动化程度不高，费时费力。

2.2 在线模式

在线模式是通过接口切换将两种不同分离机制的色谱系统串联起来，该方法可以连续收集或选择性收集第一维色谱系统的流出物，然后将流出物再注入第二维进行进一步分离。因此，接口的开发对于在线二维液相色谱的实现具有重要意义^[20]。由于第一维馏分是直接注入第二维色谱柱中，所以必须认真考虑两个系统之间的溶剂兼容性，这是构建成功的在线二维液相色谱的关键。在线模式的优点是可以缩短对于不稳定化合物的处理时间，最大程度减少样品的损失或污染、自动化程度高和具有较好的重复性；缺点是溶剂兼容性差，切换阀、定量环及检测器的死体积容易导致峰展宽的现象^[21-24]。

2.2.1 中心切割二维液相色谱

对于LC-LC而言，从第一维洗脱出来的馏分，只将含有目标组分的馏分或感兴趣的组分转移到第二维色谱柱上继续进行分离，更适合于目标组分的分析。这种分离方式的主要特点：第一维系统中洗脱出来的组分选择性地进入第二维色谱柱，具有较高的分析效率；通常色谱峰会被整个切出，第二维的色谱柱柱长较长，足以采集到第一维流出的组分，因此梯度可比全二维长；缺点是容易造成样品的部分损失，但所获得的目标组分色谱峰的数据质量会更好^[25-27]。

2.2.2 全二维液相色谱

LC×LC是将第一维中的所有组分均注入到第二维色谱柱上进行进一步分离，两根色谱柱通过接口连接。切换阀和两个定量环是实现全面分离的最常用接口。该接口不仅将第一维色谱中所有组分自动化切入到第二维色谱中，还起到将第一维色谱流出馏分富集的作用，适合复杂样品中未知化合物的分析。此外，进入到第二维色谱柱的组分必须在后续馏分切入到第二维色谱柱之前完成分离。因此，第二维的分析时间应小于或至少等于阀的切换周期^[28]。在线全二维液相色谱的主要特点是：从第一维色谱柱中洗脱出来的组分全部进入第二维色谱柱中得到进一步分离；第一维的色谱峰至少要被切割成3~4个馏分进入到第二维色谱柱中进行分离，这样才能保证得到较高的二维色谱分辨率；在线全二维液相色谱系统所获得的数据需要特定软件及化学计量工具来处理；由于第二维色谱交替分析第一维色谱的洗脱液，因此整个全二维色谱一次的分析时间取决于第一维色谱的分析时间^[29]。

3 不同分离模式的二维液相色谱在中药分析中的应用

2D-LC作为强大的分离技术已经在众多领域中应用，尤其是在中药化学成分表征、质量控制、活性成分筛选领域中^[30-33]。根据样品与固定相或流动相之间相互作用的类型，确定2D-LC中1D和2D的分离模式。目前，已经构建了多个不同分离机制的二维液相色谱柱组合，例如：HILIC×RPLC、SEC×RPLC、RPLC×RPLC、HILIC×HILIC、NPLC×RPLC、IEC×RPLC、RPLC×HILIC等。二维液相色谱系统的构建，有助于中药中不同类型成分的分离^[8-9]。值得注意的是，RPLC通常以第二维形式使用，这可能是因为RPLC应用最为广泛，能够快速平衡和具有良好的峰形。而且，RPLC与检测器，尤其是质谱仪具有良好的兼容性。本文总结了近年来在已发表文献中几种常用的分离模式在中药分析中的应用。

3.1 RPLC-RPLC模式

RPLC-RPLC模式是最常用的二维液相色谱模式，在中药的系统物质基础研究及代谢产物分析中应用非常广泛，尤其是其中包含相似分子量、极性和结构的小分子。虽然RPLC-RPLC模式会降低峰容量，但其具有比其他模式更好的流动相相容性。为提高该模式色谱系统的选择性，可通过两维间使用不同的固定相、改变两维流动相组成以及优化洗脱梯度来实现。赵雅清等^[34]构建了离线二维RPLC/RPLC系统，以环氧四氮唑色谱柱为第一维色谱柱，以Unitary C₁₈色谱柱为第二维色谱柱，第一维的18个馏分进入第二维色谱得到进一步分析，结果显示有效增加了巴天酸模根分离的峰容量，对巴天酸模根乙酸乙酯萃取层的化学成分起到了有效分离的作用。Li等^[35]为了研究白花蛇舌草中的微量成分，开发了2D RPLC/RPLC与四极杆飞行时间质谱联用的方法，该方法以Click OEG为第一维色谱柱，C₁₈为第二维色谱柱。从白花蛇舌草提取物中检测到大量的微量组分（> 400），其中有38个化合物被初步鉴定。Teng等^[36]开发了离线二维RPLC-RPLC系统系统，第一维使用CN柱，第二维使用C₁₈柱，用于分离龙血树木质部中提取出来的成分。

3.2 NPLC-RPLC模式

由于NPLC与RPLC的选择性差别最大，所以理论上NPLC-RPLC模式是2D-LC中分离效能最高的模式，但NPLC中常用的流动相与RPLC中常用的流动相难以兼容，目前难以达到理想状态。在这种情况下，可以采用一维中使用细内径色谱柱或填充毛细管色谱柱、升高第二维柱温、釆用离线模式和采用第一维正相流动相在接口处蒸发等方法，有效避免流动相不兼容问题^[37]。兰韬等^[38]在第一维中釆用Hypersil SiO₂色谱柱，以正己烷和1，4-二氧六环作为一维流动相，第二维采用Kromasil Cl8色谱柱，以含有异丙醇的流动相梯度洗脱，并通过升高第二维柱温的方法来提高两维流动相的兼容性，构建了NPLC-RPLC二维液相色谱系统对中成药正天丸进行分析，系统峰容量达到1220。田宏哲等^[39]以高温正相色谱（CN色谱柱）为第一维，室温反相色谱（C18色谱柱）为第二维，分别建立了中心切割二维液相色谱和全二维液相色谱系统。甘草提取液样品先在第一维进行正相分离，第一维的馏分选择性地或者交替存储在十通阀上的定量环中，然后切换十通阀，存储在定量环中的第一维馏分转移到第二维进行反相分离。该系统降低了第一维洗脱产物在第二维柱头的扩散，解决了正相色谱与反相色谱联用过程中的色谱峰展宽问题，提高了分离效率。Jia等^[40]首先建立了二维NPLC/RPLC-Q-TOF-MS方法来分离和鉴定玉屏风中的化学成分，第一维用TSK gel Amide-80正相色谱柱，以乙腈/水为第一维流动相，第二维用Waters UPLCBEH C₁₈色谱柱，以甲醇/甲酸水为第二维流动相，总共检测到了3 306种化合物。

3.3 HILIC-RPLC模式

HILIC是一种使用极性固定相及水相缓冲液-有机溶剂作为流动相的色谱，与正相色谱相似，用于改善强极性物质的保留和分离选择性；另外，HILIC的分离机理与RPLC完全不同，两者的分离选择性有很好的正交性，同时两者的流动相体系却又相似，因此非常适合构建HILIC-RPLC二维液相色谱系统^[41-43]。Ji等^[44]建立了离线HILIC/RPLC 2D LC与二极管阵列检测器（DAD）和四极杆飞行时间质谱联用的方法并首次用于分析银杏提取物。经过优化了两维的色谱柱和流动相后，选择使用Waters Xbridge Amide柱和乙腈/水/甲酸分别作为第一维色谱柱和流动相，并将获得的馏分在Agilent Zorbax XDB-C₁₈柱上进一步分离，流动相为甲醇/水/甲酸。结果表明，该系统具有较高的正交性和峰容量，总共检测到了125个化合物，其中有104个化合物被表征。Pan等^[45]基于离线HILIC/RPLC二维液相色谱串联四极杆轨道阱高分辨质谱方法，对金银花中的化学成分进行系统表征。以AcchromXamide柱为第一维色谱柱，Agilent Poroshell EC-C18柱为第二维色谱柱，两维流动相均为乙腈/水/甲酸，共鉴定了537种化合物，其中包含了136个新颖化合物。Zhang等^[46]基于HILIC/RPLC二维液相色谱系统制备了芪参益气滴丸中的生物活性成分，以Acchrom Unitary XAmide柱为第一维色谱柱，SB C₁₈柱为第二维色谱柱，对丹酚酸、皂苷和黄酮这些极性相似且难以在单根色谱柱上分离的化合物起到了更好地分离的作用。Chen等^[47]基于UHPLC/Q-Orbitrap-MS平台同时结合数据非依赖性采集（DIA）模式构建了离线HILIC/RPLC二维液相色谱系统，使用Waters Xbridge Amide作为第一维色谱柱，Waters ACQUITY UPLC HSS T3为第二维色谱柱，对绵萆薢中的化学成分进行了表征，共鉴定出137个化合物，该方法快速、灵敏、高效，为绵萆薢化学成分的系统表征提供了参考依据。

3.4 IEC-RPLC模式

IEC是以离子交换树脂或化学键合离子交换剂为固定相，利用被分离组分离子交换能力的差别或选择性系数的差别而实现分离的色谱方法。对于中药中带电化合物（如生物碱）的分析，IEC-RPLC模式会起到很好的效果。使用具有一定pH值和离子强度的缓冲溶剂在第一维的离子交换色谱中将组分洗脱出来，然后将所得馏分转移到第二维的反相色谱中^[48]。Long等^[49]开发了一种强阳离子交换色谱/带正电的反相色谱系统，结果证明该方法能去除非生物碱并以峰形对称和高正交性实现生物碱的分离。然后将该系统应用于唐古特雪莲中生物碱的纯化，总共获得了超过19个纯度在95%以上的生物碱，其中有一个被鉴定为新型生物碱。Zeng等^[50]为了更好地分析和分离黄连中的生物碱成分，开发了一种在线二维微流速液相色谱系统。通过使用带有富集小柱的阀切换系统来将从第一维强阳离子交换柱洗脱下来的馏分浓缩、脱盐，然后再转移到第二维反相色谱。在最优条件下，该系统将黄连中的成分很好地分离，并检测到了超过420个化合物。

3.5 SEC-RPLC模式

SEC-RPLC系统是分离分子量明显不同的天然产物的更好选择。SEC的分离原理是根据化合物尺寸的大小进行分离样品，而RPLC是基于分析物的疏水性。因此，SEC-RPLC模式具有良好的正交性，并且分离基于化合物的不同分子量和结构类型。Wang等^[51]通过凝胶色谱（Sephadex LH-20）和反相色谱的联用，构建了一个在线全二维液相色谱系统。以红花作为研究对象，比较了Sephadex LH-20-RPLC、RPLC-RPLC、HILIC- RPLC这3种联用模式的分离效果，结果表明Sephadex LH-20-RPLC模式显示出了远优于其他两个模式的正交性（72.9%）和分离度。Ma等^[52]建立了SEC×RPLC-TOF-MS系统来分析清开灵注射液中的化学成分。绘制包含二维保留时间、质荷比、峰强度的4D数据图检测到了398个峰。与传统的二维液相色谱相比，分析时间减少了约75%，并且识别的组分增加了3倍左右。

4 总结与展望

在近几十年中，已经采用了很多新颖的方法来对中药进行全面的分析。在本文中，介绍了二维液相色谱技术以及各种分离模式在中药分析中的代表性应用。与传统的一维液相色谱相比，2D-LC凭借其较高的峰容量和选择性，在中药化学成分的全面分析、目标化合物的纯化、生物活性成分的筛选和质量控制中有着十分突出的优势。构建正交性越高的2D-LC可以获得更高的峰容量，这对表征中药中微量及痕量组分是非常重要的^[53]。因此，仍需要对具有不同选择性的固定相进行技术上的改造，以达到更高的正交性。此外，使用快速、灵敏、准确的检测器来识别2D-LC分离出的大量化合物是非常必要的，如2D-LC与质谱联用技术能大大提高分离效率^[54]。另一方面，2D-LC会生成大量的数据，这需要开发更加高效、便捷的计算工具和软件，这也是二维液相色谱技术未来发展的重要任务。相信随着新技术和新方法的发展和完善，二维液相色谱技术必将在中药分析领域中发挥更加强大的作用。