经典名方开心散（KXS）最初记载于唐代孙思邈所著的《备急千金药方·卷十四》，由远志、人参、茯苓、石菖蒲4味药物组成。经文献考证4味药物的比例为远志∶人参∶茯苓∶石菖蒲=1∶1∶2∶1^[1]。其中远志安神益智，交通心肾，祛痰消肿；人参补气固脱，生津养血，宁心益智；茯苓利水渗湿，健脾宁心；石菖蒲开窍豁痰，醒神益智，化湿开胃^[2]。各味药物活性物质之间相互协同，配伍主治好忘。临床常被用来治疗阿尔茨海默病^[3-4]、血管性痴呆^[5]、认知障碍^[6]等以记忆功能障碍为主要表现的疾病，同时对抑郁^[7-8]、失眠^[9]、疲劳^[10]、糖脂代谢紊乱^[11]等疾病亦有积极的治疗效果。

散剂作为中药常用剂型之一，是指将药物粉碎后混匀成粉末状，具有制备简单、起效迅速、服用方便、有效成分利于溶出、药材利用度高、节约药物资源等优势，在历代方剂中使用频率颇高，历史悠久^[12-13]。《中华人民共和国药典》2015年版记载的粉碎方法有“用时捣碎”“用时打碎”“切碎”“碾碎”“砸碎”“打成碎块”“研粉”“研末”“挫成粉末”“水飞”等方法^[14]。目前，KXS的相关研究主要集中于化学成分^[15-16]、药理机制^[17-18]及体内代谢^[19]方面，而关于KXS制备工艺方面的研究相对较少，其粉碎方式的研究未见文献报道。因此，本研究以KXS为研究对象，以传统捣碎、传统碾碎、现代机器粉碎对药材进行处理，采用高效液相-二极管阵列检测器（HPLC-PDA）法检测非挥发性成分，顶空固相微萃取-气质联用（HS-SPME-GC/MS）法检测挥发性成分，旨在探究不同粉碎方式对KXS成分含量的影响，为KXS药材粉碎工艺提供参考依据。

1 仪器与试药 1.1 仪器

手持式红外测温仪，苏州特安斯电子有限公司；DLS粒径测定仪，美国布鲁克海文仪器公司；LC高效液相色谱仪，SHIMADZU日本岛津公司；HyPURITY C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm），塞默飞世尔科技有限公司；7890B-7000D三重四极杆气质联用仪，美国Agilent公司；手动固相微萃进样器，德国Gerstel公司；HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），美国Agilent公司；SPME萃取纤维（100 μm PDMS，85 μm Polyacrylate，65 μm PDMS/DVB，50/30 μm DVB/CRA/PDMS），美国Supelco公司；AL204型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；KQ2200DB型数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；Cascada^TM超纯水机，美国PALL公司；中药捣药罐（纯铜），中药碾药槽（纯铜），天津市宏兴铸造厂；中草药粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 试药

对照品远志酮Ⅲ（批号111850-201705，纯度≥96.5%）、3，6’-二芥子酰基蔗糖（批号111848-201604，纯度≥96.7%）、人参皂苷Re（批号110754-202028，纯度≥98%）均购于中国食品药品检定研究院，人参皂苷Rg1（批号22427-39-0，纯度≥98%）、人参皂苷Rb1（批号41753-43-9，纯度≥98%）均购于上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯，购于美国Fisher公司；磷酸为分析纯，购于天津市风船化学试剂科技有限公司；水为超纯水；混合正构烷烃对照品（C8-C20）购于美国Sigma-Aldrich公司。

远志（批号190601）、人参（批号190704）、茯苓（批号190609）及石菖蒲（批号047-2017122902）均由天津中一制药有限公司提供，经天津中医药大学张丽娟教授鉴定，远志为远志科植物远志Polygala tenuifolia Willd.的干燥根，人参为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根和根茎，茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，石菖蒲为天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott的干燥根茎。

2 方法与结果 2.1 KXS散剂的制备

按比例称取各单味药，混合，以不同粉碎方式（传统捣碎、传统碾碎、现代机器粉碎）处理，将细粉过6号筛，直至95%质量以上的药材均已过筛，即得KXS散剂，每种粉碎方法制备3份。

2.2 KXS粉碎过程中温度变化及成品粒径考察 2.2.1 温度测定

粉碎前记录各单味药材的初始温度，粉碎过程中30 s进行1次测温（共测5次），结果见表 1及表 2。

2.2.2 粒径测定

精密称取3种粉碎方式制得的KXS 0.01 g，置于10 mL容量瓶中，加少量纯水摇匀，再加纯水定容至刻度线，超声混合30 min，拿出冷却至室温，粒径仪测定粒径，结果见表 3。

2.3 HPLC-PDA法测定不同粉碎方式下非挥发性成分含量 2.3.1 对照品溶液制备

分别精密称取远志酮Ⅲ、3，6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1对照品适量，置于5 mL容量瓶中，加入75%甲醇溶解定容至刻度线，配制成质量浓度分别为0.222 0、0.334 2、0.511 8、0.323 0、0.170 8 mg/mL的标准品母液。测定前用75%甲醇稀释0、2、4、8、16、32倍，得到系列质量浓度的标准品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备

精密称取KXS 2.0 g，置于10 mL容量瓶中，加适量75%甲醇，超声45 min，冷却15 min，再次超声45 min，冷却至室温，加75%甲醇定容至刻度，抽滤，取滤液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3.3 色谱条件

色谱柱：HyPURITY C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm）；柱温：30 ℃；流动相：0.05%磷酸水溶液-乙腈，梯度洗脱：0~25 min，19%~21%乙腈；25~35 min，21%~21%乙腈；35~40 min，21%~32%乙腈；40~55 min，32%~40%乙腈；55~60 min，40%~95%乙腈；60~65 min，95%~95%乙腈；65~75 min，95%~19%乙腈；流速1 mL/min；进样体积50 μL；检测波长203 nm。混合对照品溶液、供试品溶液色谱图见图 1。

2.4 方法学考察 2.4.1 线性关系考察

精密量取系列质量浓度的标准品溶液，75%甲醇配制成6个不同浓度的混标溶液，按照“2.3.3”项中的色谱条件进样，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，计算回归方程及相关系数，结果见表 4，表明其线性关系良好。

2.4.2 精密度实验

精密量取“2.3.1”项中5种标准品溶液各1 mL，置于5 mL容量瓶中，加75%甲醇定容至刻度线，按照“2.3.3”项中的色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算远志酮Ⅲ、3，6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1峰面的RSD值，结果分别为1.24%、1.48%、1.06%、1.11%、1.35%，RSD值均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性考察

取“2.1”项中制备的KXS，按“2.3.2”项中的方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项中的色谱条件进样，记录各组指标成分的峰面积，计算RSD值，该条件下各指标成分的峰面积RSD值分别为2.64%、0.54%、2.49%、2.78%、1.47%，RSD值均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.4.4 稳定性考察

取“2.1”项中制备的KXS，按“2.3.2”项中的方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项中的色谱条件进样，分别在0、2、4、8、12、24 h分别进样1次，记录各组指标成分的峰面积，计算RSD值。远志酮Ⅲ、3，6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的峰面积RSD值分别为1.14%、0.52%、1.47%、1.49%、1.46%，RSD值均小于3.0%，表明该供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.5 加样回收率考察

精密称取已知指标成分含量的KXS 2.0 g，分别加入约与样品等量的各对照品，按“2.3.2”项中的方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项中的色谱条件进样。计算远志酮Ⅲ、3，6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的平均加样回收率并计算RSD值，平均加样回收率分别为96.56%、97.88%、99.32%、98.37%、99.20%，RSD值分别为0.77%、0.83%、1.62%、1.37%、0.96%。

2.4.6 不同粉碎方式对KXS非挥发性成分的影响

精密称取传统捣碎、传统碾碎、现代机器粉碎条件下制备的KXS样品每份2.0 g，按“2.3.2”项中的方法制备供试品溶液，每种粉碎方法制备3份供试品，按“2.3.3”项中的色谱条件进样检测，记录峰面积，代入标准曲线方程，计算出各指标成分的含量，结果见表 5。

结果显示，传统捣碎及碾碎制得的KXS中各指标成分含量均高于由现代机器粉碎制得的KXS，而捣碎与碾碎相比，由碾碎制备的KXS中各指标成分含量较高。

2.5 HS-SPME/GC-MS法测定不同粉碎方式下挥发性成分含量 2.5.1 顶空固相微萃取条件

分别称取“2.1”项中的KXS粉末各0.1 g于20 mL的顶空瓶中，迅速压紧瓶盖，备用。

2.5.2 色谱质谱条件

色谱柱：Agilent HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：250 ℃；载气为氦气（＞99.999%）；载气流速：1 mL/min；分流比为2∶1；程序升温条件：以初温45 ℃保持2 min，以12 ℃/min的速率升至117 ℃，以1 ℃/min的速率升至138 ℃，再以4 ℃/min的速率升至142 ℃，保持0.5 min，最后以20 ℃/min的速率升至230 ℃，保持3 min。孵化温度为55 ℃，孵化时间为55 min，吸附时间为40 min，解吸时间为300 s；质谱检测器离子源为EI离子源，电离电压为70 eV，离子源温度为230 ℃，四极杆温度为150 ℃，质量扫描范围为30~500 amu，全扫描模式采集，质谱标准库为NIST17。

2.5.3 不同粉碎方式对KXS挥发性成分的影响

KXS总离子图如图 2所示，根据匹配度、保留指数及参考文献对各色谱峰进行定性分析，采用峰面积归一法确定各成分的相对百分含量^[20]，结果见开放科学（资源服务）标识码（OSID）。从不同粉碎方式处理的KXS中共鉴定出56种共有化合物，分别占总挥发性成分的93.19%（捣碎）、94.16%（碾碎）、94.04%（现代机器粉碎），可将其分为8类化合物，包括醚类、萜类、醇/酸/醛类、酯/酮类、碳氢化合物。其中醚类占比最高，达80.38%，种类有7种；萜类种类最多，有36种，占比为12%；醇/酸/醛类6种、酯/酮类4种、碳氢化合物3种，分别占比为0.99%、0.24%、0.19%。

选取8种相对百分含量较高的化合物进行分析，结果显示，（+）-长叶环烯、β-石竹烯、β-细辛醚在传统捣碎条件下占比最大，分别为1.09%、1.15%、43.98%。其中（+）-长叶环烯、β-石竹烯在传统捣碎、碾碎条件下占比差异不大，在现代机器粉碎条件下占比最小，分别为0.93%、1.02%。β-细辛醚在传统碾碎、现代机器粉碎条件下占比差异不大，在传统碾碎条件下占比最小，为43.22%；白菖烯、异丁香酚甲醚、γ-细辛醚在碾碎条件下占比最大，分别为1.45%、4.84%、24.32%。其中白菖烯在传统捣碎、碾碎条件下占比差异不大，在现代机器粉碎条件下占比最小，为1.27%。异丁香酚甲醚、γ-细辛醚在传统碾碎、现代机器粉碎条件下占比差异不大，在传统捣碎条件下占比最小，分别为4.21%、23.62%；甲基丁香酚和α-细辛醚在现代机器粉碎条件下占比最大，分别为6.58%、1.40%。甲基丁香酚在传统碾碎、现代机器粉碎条件下占比差异不大，在传统捣碎条件下占比最小，为5.54%。α-细辛醚在传统捣碎、碾碎条件下占比差异不大，在传统碾碎条件下占比最小，为1.16%。

3 讨论

粉碎方式作为中药材前处理的一种，对其药效的影响不容忽视，在粉碎过程中温度与粉末粒径可能对KXS的成分含量有所影响，因此本实验对这两个因素进行了考察。结果表明，虽然散剂粉末均通过6号筛，但由于机器粉碎在粉碎过程中混合更加均匀，粉碎力度更大，同时由于机器刀头剧烈摩擦，因此粒径较其他两种粉碎方式要小且在粉碎过程中升温非常明显，温度最高达55 ℃，传统碾碎比传统捣碎制得的散剂粒径更小，在温度方面差异不大且各批次间基本没有差异。

对于5种非挥发性成分，现代机器粉碎制得的KXS均低于其他两种制法，推测由于高温使各种物质之间发生了相互作用，导致其部分成分发生了变化，且粉碎过程中的剧烈搅拌更加加剧了这种情况。而传统捣碎、碾碎均为人工操作，在粉碎过程中温度相差不大，但碾碎制得的KXS成分含量略高于捣碎，推测是由于碾碎更加能够将各单味药物混合均匀，也更加能够将其充分粉碎，所得粉末粒径更小所造成；HS-SPME/GC-MS法鉴定出的56种共有成分均占总挥发性成分的90%以上，其中由传统碾碎制备的KXS挥发性成分占比最高，为94.16%。除3种细辛醚外，（+）-长叶环烯、β-石竹烯、白菖烯、异丁香酚甲醚、甲基丁香酚的占比也高于其他成分，推测在KXS发挥药效时起到潜在作用。此8种成分中，有6种在由传统捣碎、碾碎制得KXS中的相对百分含量较高，虽然某些成分在传统捣碎、现代机器粉碎制得的KXS中占比较高，但均与传统碾碎相差不大。因此，综合两种检测KXS成分含量的方法，在其前处理过程中，以传统碾碎制备KXS能够较大程度保留其成分。对于本方，从目前的结果来看不同的粉碎方式已对其成分含量产生了一定影响，此种差异是否会在药效方面产生影响，还有待进一步研究证实。