新型冠状病毒感染传染性强，传播速度快，对社会经济发展和人类生命健康安全构成巨大威胁，临床表现主要为发热、干咳、乏力等，部分患者出现鼻塞、流涕、咽痛、嗅觉味觉减退或丧失、结膜炎、肌痛和腹泻等症状^[1]。截至2023年4月12日，世界卫生组织（WHO）报告了超过7.6亿例确诊病例，死亡人数近690万例^[2]，给全球公共卫生安全带来巨大挑战。

COVID-19由新型冠状病毒感染引起，随着病毒不断变异，奥密克戎变异株成为现阶段主要流行的病毒株，临床循证医学证据表明，中医药的早期介入有利于阻断COVID-19的发生发展^[3-4]。《天津市新型冠状病毒肺炎中医药防治方案（试行第六版）》密切接触者预防方案和无症状感染者治疗方案中，“清感饮”系列茶药被列为推荐的有效药物^[5]。清感冬饮作为防治COVID-19的推荐药物，在临床中广泛应用^[6]。该方由黄芪、虎杖、炒牛蒡子、射干、桔梗、赤芍、紫苏叶、金银花、焦山楂、甘草片和红茶11味中药组成，具有益气固表、清热解毒、清咽利喉、宣肺止咳等功效。

目前，清感冬饮的研究主要聚焦成分表征、组方分析及临床疗效评价等^[6-8]，尚无其防治COVID-19的活性物质及作用机制研究的报道。因此，本研究基于已报道的清感冬饮中所含化学成分，通过网络药理学探究组方中发挥防治COVID-19作用的潜在活性组分和作用靶点，并进一步构建分子对接模型，评价活性化合物与关键靶点间的相互作用，初步阐释清感冬饮防治COVID-19的可能作用机制，为后续研究奠定基础。

1 材料和方法 1.1 网络药理学研究方法 1.1.1 清感冬饮的信息收集和靶点筛选

基于文献中已报道的化学成分，借助TCMSP数据库^[9]（https://tcmsp-e.com/）和SwissTargetPrediction数据库^[10]（http://swisstargetprediction.ch/）获取相应靶标，并通过UniProt数据库^[11]（https://www.uniprot.org/）检索靶标对应的基因，获得确切靶标信息。

1.1.2 “药材-制剂-成分-靶点”网络构建

将清感冬饮的化学成分及其靶标信息导入Origin中，构建“药材-制剂-成分-靶点”网络图。

1.1.3 疾病靶点检索

在GeneCards数据库^[12]（https://www.genecards.org/）和DrugBank数据库^[13]（https://go.drugbank.com/）中以“novel coronavirus pneumonia”和“COVID-19”为关键词检索疾病相关靶点基因，将基因根据“relevance score”值排序筛选，通过Venny 2.1进行映射，获得清感冬饮防治COVID-19的潜在作用靶点。

1.1.4 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建及核心靶点筛选

将1.1.3中共有靶点导入STRING数据库^[14]（https://cn.string-db.org/），物种限定为“homo sapiens”，置信度为0.400，得到PPI网络。将结果导入Cytoscape^[15]软件，根据degree值进行核心靶点筛选。网络节点面积越大、颜色越明亮，表示degree值越高；边越粗、颜色越明亮，表示combined score值越高。

1.1.5 靶点通路分析

将1.1.4中核心靶点基因列表导入DAVID 6.8数据库^[16-17]（https://david.ncifcrf.gov/），限定物种为“homo sapiens”，进行基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信号通路富集分析，筛选P＜0.05的生物过程及信号通路，将结果可视化处理。

1.1.6 清感冬饮主要成分的归经网络

从2020年版《中华人民共和国药典》^[18]和文献^[19]中获取药材的归经信息，并使用Cytoscape软件绘制清感冬饮“药材-归经”网络。

1.2 分子对接研究方法

以清感冬饮的潜在活性成分作为配体，从PubChem数据库^[20]（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载其3D化学结构，并通过PDB数据库^[21]（http://www.rcsb.org/）查找筛选获得的与COVID-19相关的4个主要靶点，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）（PDB ID：1FT4）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）（PDB ID：3O96）、血管内皮生长因子A（VEGFA）（PDB ID：6ZFL）以及血管紧张素转化酶Ⅱ（ACE2）（PDB ID：1R4L），下载蛋白3D结构作为受体，采用BIOVIA Discovery Studio 2020（简称DS）软件进行分子对接。

1.2.1 蛋白准备

将蛋白结构导入DS软件，进行加氢、去水、调整键序、标准化原子名称等前处理，以原配体所在的腔隙及文献报道的具有相互作用的关键氨基酸残基作为活性位点，去除原配体后将文件保存待用。

1.2.2 配体准备

将小分子3D结构导入DS软件进行配体结构优化，小分子经加氢及能量最小化等操作后保存待用。

1.2.3 分子对接

将准备好的蛋白质受体与配体小分子在CDOCKER模式下进行精准对接。以对接自由能（-CDOCKER INTERACTION ENERGY）为评价标准，指数较高的小分子构象即为最优构象，使用PyMOL进行可视化分析。

2 结果 2.1 网络药理学分析 2.1.1 化学成分与靶点收集的结果

根据文献^[7]报道，清感冬饮通过质谱分析共鉴定了101个化学成分，在TCMSP数据库和SwissTargetPrediction数据库中获取化合物的作用靶点，使用UniProt数据库进行处理，得到药材相关的具有潜在活性的化合物45个，详见表1，相关靶点基因260个。

2.1.2 “药材-制剂-成分-靶点”网络的构建

采用Origin软件，以清感冬饮组方里的药材筛选获得的45个成分，以及成分对应的靶点，构建“药材-制剂-成分-靶点”网络，结果如图 1所示，组方里所含的多个化学成分与多个靶点相互作用，协同发挥功效。

2.1.3 COVID-19靶点检索

在GeneCards和Drugbank数据库中以“novel coronavirus pneumonia”和“COVID-19”为关键词检索合并得到699个疾病作用靶点。将筛选得到的疾病靶点与药物靶点进行映射，得到66个共有靶点，如图 2所示。

2.1.4 化学成分与靶点的PPI网络构建

将清感冬饮与COVID-19的共有靶点输入STRING数据库进行蛋白间相互作用分析，设定置信度为0.400并隐藏游离节点，得到PPI网络，如图 3所示。运用Cytoscape软件的Network Analyzer工具进行网络可视化，如图 4，该网络共包含65个节点和812条边，节点的平均degree值为25.0。拓扑分析后选取degree值排名前30的靶点，如图 5所示，提示这30个靶点可能是清感冬饮防治COVID-19的潜在关键靶点。

2.1.5 核心靶点通路分析结果

运用DAVID 6.8对2.1.4中30个核心靶点基因进行GO富集分析和KEGG信号通路富集分析（P＜0.05），选择P值排名前20的条目绘制水平柱状图，如图 6~9所示。GO富集分析获得生物过程324个、细胞组分24种以及分子功能45种，KEGG信号通路富集分析获得123条信号通路，主要包括Toll样受体（TLR）、白介素-17（IL-17）、COVID-19及炎症性肠病（IBD）等信号通路及相关靶点基因，与免疫调节、炎症修复、病毒抑制等生理过程密切相关，提示清感冬饮的活性成分具有抑制病毒入侵、改善炎症反应、调节免疫功能等潜在的生理活性，多组分协同，多靶点、多途径发挥防治COVID-19的功效。

2.1.6 “药材-归经”网络

根据2020版《中国药典》中清感冬饮主要药味的归经信息构建“药材-归经”网络，如图 10所示，11味中药中有9味归肺经，多数药材归为肺、胃、脾经，提示组方药材对肺部疾病具有靶向性，具有化痰、宣肺、平喘的作用，与报道的组方可改善胸闷、咳嗽、呼吸不畅等肺部症状结论一致。

2.2 分子对接分析

本研究基于网络药理学分析获得的45个具有潜在活性的中药小分子与PPI网络分析所得潜在关键靶点，即TNF-α、AKT1、VEGFA，以及与病毒入侵相关的重要靶点ACE2进行分子对接，其对接自由能如表1所示，对接结果如图 11所示。对接自由能取负值后进行排序，将取负值后的对接自由能在40-70 kcal/mol之间定义为中等结合，大于70 kcal/mol定义为强结合，结果显示：与TNF-α对接的化合物中，中等结合强度的有2个（山柰酚-3-O-芸香糖苷和鸢尾苷）；与AKT1对接的化合物中，中等结合强度的有33个，强结合的有9个（芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、原花青素B1、牛蒡酚E、鸢尾甲苷B、牛蒡子素A、牛蒡苷、原花青素B2、鸢尾苷）；与VEGFA对接的化合物中，中等结合强度的有24个，其中结合能大于50的有12个（芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、鸢尾苷、鸢尾甲苷B、牛蒡酚E、异绿原酸B、原花青素B1、异绿原酸A、原花青素B2、鸢尾甲苷A、牛蒡子素A、牛蒡苷）；与ACE2对接的化合物中，中等结合强度的有13个，强结合的有30个，其中结合能大于80的有15个（山柰酚-3-O-芸香糖苷、异绿原酸B、原花青素B2、原花青素B1、表没食子儿茶素没食子酸酯、异绿原酸A、大黄素-8-O-葡萄糖苷、虎杖苷、牛蒡苷、芦丁、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、牛蒡酚E、牛蒡子素A、马钱酸、鸢尾甲苷B）。配体小分子与文献报道的作用位点的关键氨基酸残基具有氢键、π-π共轭、盐桥等相互作用，能够结合于靶蛋白的活性作用口袋，对靶蛋白具有潜在的亲和作用。通过归一化后综合排序评估，山柰酚-3-O-芸香糖苷和芦丁是组方中最具有抗病毒和抗炎潜力的化合物。

3 讨论

本研究通过网络药理学探究清感冬饮防治新冠肺炎的潜在物质基础与作用机制，并通过分子对接筛选活性成分与靶点的最优复合物结构，评价小分子与靶点的结合方式，基于受体-配体相互作用模式，探究清感冬饮防治新冠肺炎的机制。

清感冬饮由黄芪、虎杖、炒牛蒡子等11味中药组成，据研究报道COVID-19致病因素为湿毒，病位在肺^[22]，组方中黄芪补肺健脾^[23]，虎杖能够改善肺血管重构，抑制肺纤维化^[24]，紫苏宣降肺气^[25]，牛蒡子宣肺袪痰、润肺止咳^[26]，金银花清热解毒、宣散风热^[27]，射干降火解毒、祛痰利咽、散结消炎、消肿止痛^[28]，桔梗宣肺祛痰、利咽排脓^[29]，赤芍清热凉血、散瘀止痛^[30]，焦山楂消食化积、行气散瘀^[31]，甘草镇咳祛痰^[32]，配以红茶，性温调和脾胃。组方11味中药有9味归肺经，多味中药归脾经和胃经，提示其作用机制可能与升降脾胃而祛湿败毒密切相关，以上各药相配伍，协同发挥益气固表、清肺排毒、清咽利喉、宣肺止咳之功效。

本研究以组方鉴定获得的101个成分进行网络药理学分析，经网络拓扑分析发现作用于COVID-19的潜在活性成分有45个，包括表没食子儿茶素没食子酸酯、迷迭香酸、咖啡碱、（-）-表儿茶素、野鸢尾黄素等，涉及黄酮类、有机酸类、生物碱类、萜类等多种活性成分，其中天然黄酮类成分21个，占比45.7%。据研究报道：黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、降压、降血脂等多种作用，且黄酮类成分经肠道微生物降解，产生的代谢物被吸收后，可以上调Ⅰ型干扰素信号通路，进而增强机体免疫保护，激活抗病毒免疫反应^[33]。

清感冬饮活性成分与COVID-19共有靶点66个，结合PPI网络分析及预测，VEGFA、AKT1和TNF-α等为关键核心靶点，这些核心靶点共同参与内分泌系统、免疫系统等综合调节，发挥防治COVID-19的作用。VEGFA属血管内皮生长因子，多种细胞可分泌VEGFA，具有调节血管通透性的作用^[34-35]，促进肿瘤血管形成，VEGFA在COVID-19患者体内表达水平显著升高，与疾病严重程度呈正相关性^[36]，影响新生血管的形成。TNF-α是急性肺损伤中上调的促炎细胞因子之一，参与正常的炎症反应和免疫反应，属于炎症级联反应上游启动的关键细胞因子，在炎性病理状态下显著增加，TNF-α抑制剂可用于减缓COVID-19的炎性反应^[37]。AKT1又称为蛋白激酶B α，通过调节PI3K/AKT信号通路，调控细胞增殖与凋亡，AKT1的活化与肿瘤的发生和发展密切相关，据报道AKT1在炎症的产生与肺炎症细胞的存活和氧化应激中也发挥重要作用，影响COVID-19等多种呼吸系统疾病的发生发展^[38-40]。ACE2受体是SARS-CoV-2入侵宿主细胞的关键功能受体，介导病毒入侵^[41]。SARS-CoV-2通过表面刺突蛋白特异性识别肺泡上皮细胞表面的ACE2受体，通过膜融合感染宿主细胞，完成病毒的复制和组装，重新释放，引发细胞因子风暴等炎症反应，加速疾病的进展^[42]。

富集分析结果显示，组方治疗COVID-19可能与脂多糖（LPS）介导的信号通路、脂质和动脉粥样硬化、TLR信号通路、IL-17信号通路、晚期糖基化终末产物及其受体（AGEs-RAGE）糖尿病并发症信号通路等途径相关，参与免疫调节、炎症修复和病毒抑制等多个生理过程。

以富集分析获得的核心通路中的核心靶点，锁定四个关键靶标，即VEGFA、AKT1、TNF-α和ACE2，涉及基因表达、细胞增殖、细胞凋亡、药物结合反应等多个生物过程。以分子对接验证4个核心靶点对45个潜在活性成分的亲和力，对接结果显示，山柰酚-3-O-芸香糖苷、芦丁、原花青素B1、原花青素B2、鸢尾苷、鸢尾甲苷B、异绿原酸A/B、牛蒡苷、虎杖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、表没食子儿茶素没食子酸酯等多个化合物与多个核心靶点具中等及以上强度的结合活性，形成较稳定的结合构象，涵盖黄酮类、有机酸类、木脂素类、萜类等多种化合物类型，归属组方中包含金银花、红茶、虎杖、紫苏、射干、牛蒡子等在内的多味药材，说明组方通过有效配伍，多成分、多靶点、多途径协同发挥防治COVID-19的功效。

在筛选的活性成分中，通过归一化研究分析发现山柰酚-3-O-芸香糖苷和芦丁对VEGFA、AKT1、TNF-α和ACE2均具有较好的结合活性。山柰酚-3-O-芸香糖苷属黄酮苷，具有抗糖化活性和神经保护作用，在治疗炎症方面，可通过抑制相关促炎因子的释放或调控炎症相关通路发挥抗炎作用，对炎症诱发的疾病具有一定的治疗作用^[43-44]。芦丁又称为芸香苷，属于天然的黄酮苷，据研究报道，芦丁具有抗炎、抗氧化活性，可减轻细胞和组织损伤^[45-47]。山柰酚-3-O-芸香糖苷和芦丁作为组方中天然黄酮类化合物的代表，基于结构的特征，与核心靶点自发结合，表现出较好的结合活性，表明清感冬饮的药效成分可能通过调控关键靶点，发挥抑制SARS-CoV-2入侵、缓解炎症的作用。

4 结语

本研究基于清感冬饮分离鉴定获得成分进行网络药理学分析与分子对接研究，表明清感冬饮可能通过山柰酚-3-O-芸香糖苷、芦丁等主要黄酮类成分作用于TNF-α、AKT1、VEGFA和ACE2等靶点，通过调控脂质代谢与动脉粥样硬化、TLR信号通路、IL-17信号通路等参与抑制病毒入侵、调节炎症反应等多个生理途径，协同发挥作用。组方以多个活性成分共同作用、多个关键靶点相互协同、多种作用途径相互调控发挥对COVID-19的防治作用，为清感冬饮防治COVID-19提供了科学依据，为后续的基础研究提供了理论支持。