乳腺癌是上皮细胞增殖失控所致恶性病变，位居女性恶性肿瘤首位，早期症状表现为乳房肿块和腋窝淋巴结肿大，晚期可出现远处转移^[1]。中国乳腺癌每年新增约30万人，目前乳腺癌主要以精准化综合性治疗为主，根据患者状态给予局部和全身性治疗^[2-3]。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）是具有诱导多种肿瘤细胞凋亡的内源性蛋白，但对正常细胞的毒性很小，被认为是一种潜在、较安全的抗癌剂，在恶性肿瘤治疗和预防中有较好的运用前景^[4-5]，但仍有部分恶性肿瘤细胞对TRAIL所致细胞凋亡存在抗性。芹菜素7-O-葡萄糖苷（AGL）是具有抗炎、抗癌作用的黄酮类化合物^[6]，可抑制宫颈癌细胞迁移^[7]，但AGL在乳腺癌作用机制尚不清楚。本研究旨在探讨AGL对抗TRAIL诱导凋亡乳腺癌细胞的影响，希望为恢复抗TRAIL乳腺癌细胞的TRAIL敏感性提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞

人正常乳腺细胞MCF-10A（HZNC044，上海沪震实业有限公司），人乳腺癌细胞MB231、MCF-7（HT-X1647、HT-X1646，深圳市豪地华拓生物科技有限公司）。

1.1.2 实验动物

SPF级BALB/c裸鼠，雌性，72只，3~4周龄，体质量（13±1）g，购自南方医科大学[许可证号，SCXK（粤）2016-0041]，饲养房环境为温度20~25 ℃，空气湿度50%~55%，人工光照12 h/d，饮水自由，进食自由。

1.1.3 试剂

AGL（ZT-23726，上海甄准生物科技有限公司，纯度 > 98%），N-乙酰基半胱氨酸（NAC）（A7250，美国SIGMA公司，纯度≥99%），Cas-3抑制剂z-DEVD-fmk、Cas-9抑制剂Z-LEHD-FMK（abs812077、abs813893，爱必信上海生物科技有限公司，纯度：98%），Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒（40302ES20，上海翊圣生物科技有限公司），CCK8试剂盒（40203ES76，上海翊圣生物科技有限公司），兔多抗Cleaved-Cas-9、Cleaved-Cas-3、p53上调凋亡调制物（PUMA）抗体和兔抗人p53、Cleaved PARP-1、PARP-1抗体（ATA27024、ATA25877、ATA36082、ATA34929、ATA27078、ATA35118，武汉益普生物科技有限公司），ECL Kit（ECL-0013，美北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），超氧化物歧化酶（SOD）Elisa试剂盒（R-1298，上海广锐生物科技有限公司），丙二醛（MDA）Elisa试剂盒（CK-E10376，武汉益普生物科技有限公司）。

1.1.4 仪器

高速冷冻离心机（Avanti JXN-26，Beckman Coulter），荧光显微镜（DMi8-电动，奥地利徕卡），共聚焦显微镜（STELLARIS，德国徕卡公司）。

1.2 细胞培养

MCF-10A置于DMEM/F12培养基（5%马血清、10 μg/mL胰岛素、20 ng/mL表皮生长因子、100 ng/mL霍乱毒素、0.5 μg/mL氢化可的松）37℃、5% CO₂培养，MCF-7细胞置于DMEM（10 %胎牛血清、1%丙酮酸钠）37℃、5% CO₂培养，MB231细胞置于含10% L15培养基（10 %胎牛血清）37 ℃、无CO₂培养^[8]。当各组细胞生长至80%~90%时，进行传代培养，选取第3代细胞用于后续实验。

1.3 体外实验 1.3.1 CCK-8检测细胞活力

取对数生长期的MCF-10A、MCF-7、MB231细胞种于96孔培养板（1×10⁵个/孔），同1.2培养条件培养至过夜，待贴壁后更换培养基，加入不同作用试剂，使其最终浓度为TRAIL（0、5、10、20、50、100、200 ng/mL）、AGL（0、10、20、40、80 μmol/L）、NAC（4 mmol/L）、z-DEVD-fmk（25 μmol/L）^[9]、Z-LEHD-FMK（20 μmol/L）^[10]，继续培养24 h后，加入CCK-8（20 μL/孔），避光37 ℃孵育3 h，450 nm波长检测吸光度值，细胞存活=（实验组吸光度值/对照组吸光度值）×100%。设置不做任何处理的细胞为Control组，每种浓度分别设置5个复孔，取均值作为该组结果。实验重复3次。

1.3.2 针对细胞凋亡的检测

取对数生长期MCF-10A、MCF-7、MB231细胞接种于6孔培养板（1.5×10⁵个/孔），药物作用前培养方式同1.3.1，将细胞按如下分组：MCF-10A（20 μmol/L AGL+50 ng/mL TRAIL）和MCF-7（20 μmol/L AGL+50 ng/mL TRAIL）、MCF-7[TRAIL（0、100 ng/mL）]和MB231[TRAIL（0、100 ng/mL）]，给予药物干预，培养24 h，收集细胞于3 000 r/min离心5 min，PBS洗涤2遍，弃上清液，300 μL 1×Binding Buffer缓冲液重悬细胞，加入5 μL Annex-inV/FITC和10 μL PI混合，室温避光孵育20 min，流式细胞仪上样，自带软件分析计算细胞凋亡率。复孔设置和实验次数同1.3.1。

1.3.3 蛋白免疫印迹（Western-blot）检测蛋白水平

收集1.3.1中的细胞并提取总蛋白，Bradford调整各组提取蛋白浓度一致，经SDS-PAGE凝胶电泳、电转膜至PVDF膜，密封2 h，加入兔抗人Cleaved-Cas-9、Cleaved-Cas-3、p53、PUMA、Cleaved PARP-1、PARP-1、β-actin抗体（1∶500）4 ℃孵育过夜，TBST漂洗40 min，加入HRP标记二抗（1∶500）孵育1 h，TBST漂洗40 min，ECL显影，Image Lab软件分析目标蛋白相对灰度值。实验重复3次。

1.3.4 ROS荧光检测

取对数生长期MCF-10A细胞接种于Petri培养皿（1.0×1010个），分别设置H₂O₂组（50 μmol/L）、TRAIL组（0、50 ng/mL）、AGL组（0、10、20 μmol/L）、NAC组（4 mmol/L）、50 ng/mL TRAIL+20 μmol/L AGL组、50 ng/mL TRAIL+20 μmol/L AGL+4 mmol/L NAC组，培养方式同1.3.1，培养24 h，去培养基，PBS漂洗2次，加入10 μmol/L DCFDA无血清培养液2 mL，孵育20 min，弃培养基，PBS漂洗2次，加入1 mL PBS，用于共聚焦显微镜扫描检测，λex=495 nm，λem=525 nm，ROS荧光信号为绿色。实验重复3次。

1.3.5 MDA水平和SOD活性检测

收集1.3.4中H₂O₂组（50 μmol/L）、AGL组（0、10、20 μmol/L）MCF-10A细胞，3 500 r/min离心10 min，取上清液备用，采用Elisa检测MDA水平和SOD活性。实验重复3次。

1.4 体内实验 1.4.1 移植瘤动物模型建立

将72只雌性BALB/c裸鼠随机均分为Control组和AGL+TRAIL组，将MCF-10A细胞皮下注射（5.0×10⁷个）裸鼠右前肢腋，次日，AGL+TRAIL组腹腔注射AGL[25 mg/（kg·d）]^[11]和200 μL TRAIL（1 μg/mL）^[12]，Control组给予等体积生理盐水，每隔5 d，各组随机选取5只小鼠分离移植瘤并测量肿瘤体积变化。30 d后，麻醉处死所有小鼠并分离移植瘤，测定移植瘤重量，4%中性甲醛溶液固定移植瘤，用于TUNEL检测和p53、PUMA免疫组化。

1.4.2 TUNEL检测

移植瘤常规石蜡包埋、切片（4 μm）、脱蜡，蛋白酶K修复20 min，3% H₂O₂室温5 min，PBS洗2次，TdT酶于37 ℃作用60 min，PBS洗3次，氧化物酶标记的链酶卵白素工作溶液作用30 min，PBS洗4次，0.05% DAB显色4 min，蒸馏水洗4次，苏木精复染10 min，蒸馏水洗3次，脱水，透明，封片。细胞核棕黄色或棕褐色颗粒为凋亡阳性细胞，每张片子选取5个视野，记录阳性细胞数，计算细胞凋亡率=（阳性细胞数目）/（总细胞数目）×100%。

1.4.3 免疫组化

移植瘤固定至切片步骤同1.4.2，PBS溶液漂洗、3%H₂O₂与甲醇混合液浸泡10 min，超纯水漂洗、抗原修复、PBS漂洗5 min、加入p53、PUMA一抗37 ℃反应2h、PBS漂洗5 min、加入二抗37 ℃反应40 min、PBS漂洗5 min、DAB室温显色30 min，镜检观察有棕黄色颗粒出现时自来水终止，苏木素复染30 s，后续步骤同1.4.2。

1.5 统计学分析

使用SPSS 22.0软件进行数据统计分析，GraphPad Prism 6.0软件绘制柱状图，符合正态分布且方差剂性数据均以均值±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，P < 0.05表示存在统计差异。

2 结果 2.1 TRAIL对乳腺癌细胞存活及凋亡的影响

为筛选出抗TRAIL乳腺癌细胞株，对MB231细胞株、MCF7细胞株进行TRAIL浓度梯度实验，采用CCK-8法、流式法检测细胞存活率和细胞凋亡率，结果显示TRAIL作用浓度为50、100、200 ng/mL时，MB231细胞存活率显著降低且Cleaved PARP-1水平显著升高（P < 0.05），MCF7细胞存活率变化无统计差异且无Cleaved PARP-1表达（P > 0.05）（图 1A、B）；TRAIL（100 ng/mL）作用下，TMCF7细胞细胞凋亡率无明显变化（P > 0.05），MB231细胞凋亡率升高（P < 0.05）（图 1C、D），说明MCF7细胞对TRAIL作用不敏感，对TRAIL存在抗性。

2.2 AGL和TRAIL协同促进MCF7细胞凋亡

为探究AGL联合TRAIL作用对抗TRAIL性MCF7细胞凋亡的影响，进行AGL浓度梯度处理，筛选出无细胞毒性AGL浓度与TRAIL联合作用MCF7细胞，观察细胞凋亡和Cleaved PARP-1蛋白表达情况，结果显示AGL作用浓度为40、80 μmol/L时，MCF7细胞存活率显著低于Control（P < 0.05）；TRAIL（50 ng/mL）增加AGL（20、40 μmol/L）处理时，MCF7细胞存活率显著低于TRAIL（50 ng/mL）处理（P＜0.05），Cleaved PARP-1水平显著高于TRAIL（50 ng/mL）处理（P < 0.05）（图 2A-C）。AGL（20 μmol/L）+TRAIL（50 ng/mL）处理时，MCF7细胞凋亡率显著高于AGL（20 μmol/L）处理（P < 0.05），而MCF-10A细胞与AGL（20 μmol/L）处理差异无统计学意义（P > 0.05）（图 2D、E），说明AGL联合TRAIL可能通过提高Cleaved PARP-1蛋白表达促进MCF7细胞凋亡。

2.3 AGL联合TRAIL处理对Caspases信号级联的影响

在AGL联合TRAIL处理基础上增加Caspases信号级联相关蛋白酶抑制剂，为探究AGL联合TRAIL作用促进MCF7细胞凋亡的作用机制，结果显示TRAIL（50 ng/mL）、AGL（20 μmol/L）作用24 h时，MCF7细胞均未检测出Cleaved PARP-1、Cleaved-Cas-3、Cleaved-Cas-9表达；TRAIL（50 ng/mL）+AGL（20 μmol/L）作用8 h、16 h和24 h时，MCF7细胞Cleaved PARP-1、Cleaved-Cas-3、Cleaved-Cas-9水平显著高于Control（P < 0.05）；TRAIL（50 ng/mL）+AGL（20 μmol/L）作用4 h时，MCF7细胞Cleaved PARP-1水平显著高于Control（P < 0.05）（图 3A）。TRAIL（50 ng/mL）分别联合AGL（10、20、40 μmol/L）作用24 h时，MCF7细胞Cleaved-Cas-3、Cleaved-Cas-9水平显著高于TRAIL（50 ng/mL）处理（P < 0.05）（图 3B）。TRAIL（50 ng/mL）+AGL（20 μmol/L）作用24 h时，MCF7细胞存活率显著低于Control（P < 0.01），而Cleaved PARP-1相对蛋白水平显著高于Control（P＜0.01）；TRAIL（50 ng/mL）+AGL（20 μmol/L）+Cas-3 inhibitor、TRAIL（50 ng/mL）+AGL（20 μmol/L）+Cas-9 inhibitor作用24 h时，MCF7细胞存活率与Control比较无统计差异（P > 0.05），且均未检测出Cleaved PARP-1表达（图 3C、D），说明AGL联合TRAIL处理可能通过促进Cleaved PARP-1、Cleaved-Cas-3、Cleaved-Cas-9蛋白表达激活Caspases信号级联反应，从而降低MCF7细胞存活率。

2.4 AGL对MCF7细胞活性氧产生的影响

进行AGL、TRAIL、AGL+TRAIL、H₂O₂、NAC、AGL+TRAIL+NAC处理MCF7细胞为探究AGL联合TRAIL处理促进MCF7凋亡是否与细胞活性氧产生有关，结果显示AGL（10、20 μmol/L）、H₂O₂（50 μmol/L）处理下的MCF7细胞ROS（+）细胞数、MDA水平显著高于Control（P < 0.05），而SOD活性显著低于Control（P < 0.05）（图 4A-C）。TRAIL（50 ng/mL）、AGL（20 μmol/L）处理下的MCF7细胞ROS（+）细胞数显著高于Control（P < 0.05），而NAC（4 mmol/L）处理下的MCF7细胞ROS（+）细胞数显著低于Control（P < 0.05）；TRAIL（50 ng/mL）+AGL（20 μmol/L）处理下MCF7细胞ROS（+）细胞数、p53、PUMA、Cleaved PARP-1相对蛋白水平显著高于TRAIL（50 ng/mL）处理（P < 0.05），而细胞存活率显著低于TRAIL（50 ng/mL）处理（P < 0.05）；TRAIL（50 ng/mL）+AGL（20 μmol/L）+NAC（4 mmol/L）处理下MCF7细胞ROS（+）细胞数、p53、PUMA、Cleaved PARP-1相对蛋白水平显著低于TRAIL（50 ng/mL）+AGL（20 μmol/L）处理（P＜0.05）（图 4D-F），说明AGL联合TRAIL可能是通过增加MCF7细胞活性氧产生和p53、PUMA、Cleaved PARP-1表达上调，加重细胞氧化应激损伤，从而促进MCF7细胞死亡。

2.5 AGL联合TRAIL对小鼠乳腺癌原位移植瘤生长的影响

为探究AGL联合TRAI对体内肿瘤生长的影响，建立裸鼠移植瘤模型，结果显示AGL+TRAIL组小鼠乳腺癌原位移植瘤重量、体积、p53阳性率、PUMA3阳性率均显著低于Control（P < 0.05），肿瘤组织细胞凋亡率显著高于Control（P < 0.05）（图 5），说明AGL联合TRAIL处理可抑制小鼠乳腺癌原位移植瘤生长。

3 讨论

TRAIL是由281AA编码形成的Ⅱ型跨膜蛋白，可通过与死亡受体结合选择性诱导肿瘤细胞凋亡^[13]，已有研究表明：多种肿瘤细胞对TRAIL呈现出抗性，其作用机制尚未完全阐明，但普遍认为与死亡受体、线粒体、PI3/AKt信号通路和MAP激酶通路等有关。本研究结果发现人MCF7细胞和MB231细胞对TRAIL敏感性存在明显差异，MB231细胞在TRAI适宜浓度处理下细胞存活率显著降低，而细胞凋亡率和Cleaved PARP-1水平明显升高，但MCF7细胞无上述相似趋势，说明MCF7细胞对TRAIL作用存在抗性。

克服TRAIL耐药性肿瘤细胞重点是如何恢复肿瘤细胞对TRAIL的敏感性，单一使用TRAIL或其他致敏剂对肿瘤细胞的灭杀效果较低，而TRAIL联合致敏剂使用可增加其对肿瘤细胞的灭杀效果，例如多酚致敏剂。AGL是一种稳定的天然黄酮物质，相比于其他芹菜素物质具有更好的溶解性，还能够抑制癌细胞、真菌生长，在细胞内、外均可促进活性氧生成，诱导细胞质膜损伤。本研究发现AGL一定浓度时可以显著抑制MCF7细胞生长，并且以非细胞毒性剂量AGL（20 μmol/L）联合TRAIL（50 ng/mL）处理可以显著提高MCF7细胞凋亡率和Cleaved PARP-1水平，但是对正常乳腺上皮细胞MCF-10A无毒性影响。有研究认为AGL比芹菜素具有更强的生物活性，在低浓度时就能促进结肠癌HCT116细胞内出现染色质浓缩、凋亡小体形成和凋亡相关基因表达，具有细胞毒性作用。本研究结果趋势也和上述前人研究趋势相似，说明AGL（20 μmol/L）联合TRAIL（50 ng/mL）能协同促进MCF7细胞凋亡。

本研究发现AGL联合TRAIL处理可促进MCF7细胞Cleaved PARP-1、Cleaved-Cas-3、Cleaved-Cas-9升高，而在两者联合作用的基础上增加Cas-3抑制剂、Cas-9抑制剂能够逆转Cleaved PARP-1水平上升。Caspases参与细胞生长、分化、凋亡等过程，一般情况下Caspases是以非活性酶原分布在细胞质中，接收凋亡信号刺激后，形成催化活性的Caspases，Cas-3、Cas-9在Caspases级联细胞凋亡反应中占据重要作用。PARP-1是细胞核酶，能够催化聚二磷酸腺苷核糖化，参与DNA损伤及修复、转录调控和细胞死亡等过程。细胞凋亡主要有Caspases依赖途径和Caspases非依赖途径，Caspases可裂解PARP-1，PARP-1裂解功能丧失是细胞凋亡顺利进展的保证，本研究结果说明AGL联合TRAIL处理促进MCF7细胞凋亡与增强Caspases信号级联反应有关。

本研究发现AGL联合TRAIL处理能促进MCF7细胞内ROS水平和p53、PUMA蛋白表达上调，而在此基础上增加NAC可降低ROS水平和p53、PUMA蛋白表达。ROS是细胞的代谢产物，可在线粒体电子传递链中产生，线粒体ROS水平异常升高可诱导线粒体膜出现去极化，改变线粒体膜结构稳定性，促凋亡因子进入胞基质诱导凋亡，线粒体介导的细胞凋亡途径也属于Caspases依赖途径之一。p53是细胞凋亡的重要调节因子，当细胞受致癌因子刺激时，p53能抑制细胞周期运行并参与细胞凋亡进程。PUMA能够被p53快速诱导表达，其翻译蛋白是Bcl-2同源家族成员，可解除Bcl-2的抗凋亡作用，促进细胞凋亡。本研究结果说明AGL联合TRAIL促进MCF7细胞Caspases信号级联反应可能与增强细胞内ROS含量和p53、PUMA蛋白表达有关。本研究还发现AGL联合TRAIL处理可抑制小鼠体内移植瘤生长、促进移植瘤组织细胞凋亡，但没有提高肿瘤组织p53、PUMA表达，可能是因为体内自身存在一套完善的免疫体系，参与移植瘤的生长调节过程，其中的具体作用机理还需要进一步探究。

综上所述，MCF7细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡存在抗性，在TRAIL处理基础上增加非细胞致毒剂量AGL可提高细胞内ROS水平和MDA含量，加重氧化应激损伤，还能激活Caspase级联反应，加快PARP-1裂解，上调p53、PUMA表达，降低MCF7细胞对TRAIL的抗性，从而促进MCF7细胞凋亡。虽然体内研究也证实AGL联合TRAIL处理可降低移植瘤细胞生长，但其作用机制还需深入研究。