心力衰竭（HF）是由心脏超负荷和损伤引起的一种异质性临床综合征，是导致发病和死亡的主要原因，也是目前日益严重的临床与公共卫生问题之一^[1-2]。据预测，至2030年将会有超过800万的成年人遭受HF影响^[3]。该病发病机制复杂，多种因素均可以促使心脏重塑，并且心血管重塑通常伴随血管生成受损，因此，促进血管新生、改善脉管血运对于HF的防治显得极为重要。中医药治疗HF具有多成分、多靶点、多途径的特点，能够有效改善HF患者临床症状及不良反应，降低住院率^[4]。本研究中的参麦方源于《症因脉治》，由红参、麦冬组成，其中红参主治体虚欲脱、肢冷脉微、气不摄血等症状，麦冬主治肺胃阴虚、心烦、失眠等症状，具有益气固脱、养阴补心之效，在治疗HF的临床实践中获得颇多良效^[5-6]。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）主要通过激活血管生成基因及其受体的转录来促进心肌血管生成^[7]，血管内皮生长因子A（VEGFA）是最有效的促血管生成因子，能够促进血管生成^[8]，而缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路的重要下游基因是血管内皮生长因子（VEGF）^[9]，HIF-1/VEGF信号通路在血管生成、稳定和成熟中发挥重要作用^[10]。然而目前对于参麦方治疗HF心血管生成的机制与HIF-1/VEGF信号通路的相关性研究相对较少，本研究通过腹腔注射盐酸多柔比星制备HF动物模型，并采用参麦方进行治疗，拟分析其对HIF-1/VEGF信号通路的影响，并阐述其作用机制。

1 实验材料及方法 1.1 实验动物

55只SPF级雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0010。饲养于天津中医药大学SPF级动物中心，分笼喂养，自由摄食与饮水，适应环境后进行实验。

1.2 药物、试剂及仪器 1.2.1 药物制备

参麦方组成：红参、麦冬（比例为1∶1）购自河北美威药业股份有限公司，并对药物进行煎煮浓缩。按照人-大鼠体表面积换算（1∶6.25），将参麦方给药剂量设定为1.1、5.4 g/kg（相当于临床等效剂量的1、5倍）。旋蒸浓缩至1 g/mL，4 ℃保存，灌胃依照不同剂量进行稀释。

1.2.2 主要试剂与仪器 1.2.2.1 主要试剂

注射用盐酸多柔比星（深圳万乐药业有限公司，批号：H44024359），氨基端前脑钠素（NT-proBNP）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号：E-EL-R3023），大鼠内皮素-1（ET-1）ELISA试剂盒（武汉基因美科技有限公司，货号：JYM0591Ra），一氧化氮（NO）检测试剂盒（碧云天生物技术，产品编号：S0021S），CD31兔多克隆抗体（美国Abcam公司，批号：AB281583），VEGFA小鼠单克隆抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司，批号：3523013119），HIF-1α小鼠单克隆抗体（品牌：赛默飞世尔科技有限公司，货号：PL205612）。

1.2.2.2 主要仪器

酶标仪（infinite200Pro），实时定量聚合酶链式反应（PCR）仪（美国Bio-rad公司），Vevo 2100成像系统（加拿大VisualSonics公司），24孔离心机（德国Eppendorf有限公司），旋转蒸发器（天津科诺仪器设备有限公司）。

1.3 实验方法 1.3.1 大鼠HF模型构建

将55只大鼠依次编号，随机分为4组：正常组（10只）、模型组（15只）、参麦高剂量组（15只）、参麦低剂量组（15只）。将10 mg的盐酸多柔比星溶于6.7 mL生理盐水中，配制成1.5 mg/mL的注射液，现用现配。正常组10只大鼠等体积腹腔注射蒸馏水1.5 mL/kg，其余45只大鼠均给予腹腔注射盐酸多柔比星1.5 mg/kg，均每周2次，连续注射8周，累积剂量为24 mg/kg。在8周末对4组存活的大鼠进行超声心动图检查以检测左心室功能，结果提示以左心室短轴缩短率（FS） < 30%为慢性HF造模成功的标准^[11]。实验过程中，模型组死亡5只并剔除造模失败的大鼠3只，参麦高剂量组死亡7只，参麦低剂量组死亡5只，最后对各组剩余大鼠（正常组10只、模型组7只、参麦高剂量组8只、参麦低剂量组10只）进行取材并分析。

1.3.2 给药方法

实验采用“边造模边给药”的方式进行，从实验第1天起，各给药组大鼠分别给予参麦方高剂量（5.4 g/kg）、低剂量（1.1 g/kg）灌胃，正常组和模型组大鼠给予等量蒸馏水灌胃，均为每日1次，连续灌胃8周。

1.4 指标检测 1.4.1 心功能相关指标测定

采用Vevo 2100成像系统测定大鼠心功能情况，包括左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（LVFS）。以上参数均连续测量3个心动周期并取平均值。

1.4.2 心脏病理学检测

取大鼠心脏组织，10%甲醛固定，经脱水、石蜡包埋处理后制成切片，采用苏木精-伊红（HE）染色及马松（Masson）染色进行病理切片染色，光学显微镜下观察心肌组织的病理变化。

1.4.3 免疫组织化学CD31染色

取大鼠心脏组织，10%甲醛固定，经脱水、石蜡包埋处理后制成切片，进行CD31染色，经CD31染色后的阳性细胞呈棕色，光学显微镜下观察心肌组织血管的变化情况，并利用ImageJ软件测定心肌组织血管阳性表达量。

1.4.4 实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）

取适量心肌组织，加入适量裂解液提取总RNA，后进行逆转录，使用RT-qPCR仪进行扩增，预变性，95 ℃15 min，PCR反应，40个循环，95 ℃10 s，60 ℃30 s，内参基因为β-actin，使用2^-ΔΔCt方法计算相对表达量。引物由上海生工生物工程公司设计合成，引物序列见表 1。

1.4.5 蛋白免疫印迹（Western Blot）

向组织中加入RIPA组织/细胞裂解液进行裂解，冰上匀浆，15 000 r/min，4 ℃离心（离心半径12 cm）后取上清液，二喹啉甲酸（BCA）定量法测定蛋白浓度。100 ℃水浴锅中变性5 min，4%~12%预制胶电泳，转移至PVDF膜，采用快速封闭液封闭处理20 min，GAPDH、VEGFA、HIF-1α一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，二抗室温1 h，TBST洗膜，显影曝光，ImageJ软件量化灰度值，以目的蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值的比值表示该蛋白表达水平。

1.4.6 统计学方法

应用Graph Pad Prim 9.0统计学软件对数据进行分析。计量资料符合正态分布且满足方差齐性时，以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠心功能指标情况

超声心动图检测结果显示，与正常组比较，模型组大鼠心功能指标LVEF、LVFS降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，参麦高、低剂量组大鼠LVEF、LVFS升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图 1、表 2。

2.2 HE染色结果

HE染色结果显示，正常组大鼠心肌组织结构正常，组织间未见明显炎性细胞浸润；模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，表现出肥大、变形，结构模糊，细胞间隙变大，细胞核破碎，心肌组织损伤严重；参麦高、低剂量组大鼠均不同程度地改善了心肌损伤情况，心肌细胞排列规则，细胞核清晰可见，炎性细胞浸润较少，其中参麦低剂量组表现与正常组接近。见图 2。

2.3 Masson染色结果

Masson染色结果显示，正常组大鼠心肌细胞形态一致，心肌纤维排列整齐；模型组大鼠心肌细胞可见网状连接、排列不规律、分布杂乱、染色不均，胶原组织显著增多，心肌组织纤维化严重；参麦高、低剂量组大鼠心肌胶原纤维沉积情况有所改善，心肌组织胶原纤维较为规整，表现出一定的抗纤维化作用，其中参麦低剂量组改善效果较为明显。见图 3。

2.4 免疫组织化学CD31染色结果

免疫组织化学CD31染色结果显示，与正常组比较，模型组大鼠微血管密度（MVD）表达减少（P＜0.01）；与模型组比较，参麦高、低剂量组大鼠心肌细胞中MVD表达升高（P＜0.05或P＜0.01）。见图 4、图 5。

2.5 参麦方对HF大鼠模型NT-proBNP、ET-1、NO水平的影响

通过ELISA法检测各组大鼠NT-proBNP、ET-1、NO水平，结果显示与正常组比较，模型组大鼠NT-proBNP、ET-1浓度升高（P＜0.01），NO浓度降低（P＜0.01）；与模型组比较，参麦高、低剂量组大鼠NT-proBNP、ET-1浓度降低（P＜0.01），NO浓度上升（P＜0.01），参麦低剂量组效果更佳。见表 3。

2.6 RT-qPCR结果

RT-qPCR结果显示，与正常组比较，模型组大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α、VCAM-1 mRNA表达水平升高，HIF-1α、VEGFA mRNA表达水平降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，参麦高、低剂量组大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α、VCAM-1 mRNA表达量降低，HIF-1α、VEGFA mRNA表达量升高，部分差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见图 6。

2.7 Western Blot结果

Western Blot结果显示，与正常组比较，模型组大鼠HIF-1α和VEGFA蛋白表达量降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，参麦高、低剂量组HIF-1α和VEGFA蛋白表达量上升，其中参麦低剂量组升高显著（P＜0.05）。见图 7、表 4。

3 讨论

中医将HF归为“心悸”“喘证”“胸痹”“水肿”等范畴，胸闷、心悸、呼吸困难等临床症状与现代HF相似，其病机以心气不足与心阴、心阳亏虚为本，即气阴两虚致心气不足，阳气虚损，进而阳虚水泛，气虚血瘀水停^[12]。血管对应中医之脉或血络，为气血运行通道，唯有血脉充盈，才能运载血液发挥濡养心脏的功能。相对而言，心气充沛，则血脉有力，气血得运^[13]。因此，心血的正常运行离不开心气推动、脉道通利及心阴与心阳之间的调和。参麦方别名参麦饮，源于《症因脉治》，由红参、麦冬组成，具有益气固脱、养阴补心之效，主治气虚喘逆、虚热、脉浮大、按之则空或见濡软、散大无神。方中红参甘、温，入脾、肺、心经，补脾益肺，益气摄血，复脉固脱。麦冬甘、寒，入心经，养阴生津，润肺清心。红参与麦冬配伍加强了益气养阴作用^[14]，符合中医对HF基本病机的认识，临床应用确有疗效。

红参是治疗HF常用的补气药之一。现代药理学研究表明，参麦方中红参及其成分具有促进微循环、抗氧化、抗疲劳、增强免疫功能等作用^[15]。研究证实，红参水煎液能够提升HF大鼠LVEF、降低NT-proBNP含量，其机制可能是通过增强抗氧化能力，降低氧化应激水平，进而发挥对心脏的保护作用^[16]，与本研究结果一致。麦冬的化学成分具有保护心血管、抗炎、抗氧化、抗衰老、免疫调节等药理作用^[17]。其中，麦冬皂苷D不仅能够对抗血管内皮细胞凋亡^[18]，对心肌细胞缺氧复氧损伤亦具有保护作用^[19]。

阿霉素是一种广谱、高效的蒽环类抗肿瘤药物。研究表明，阿霉素可以建立稳定、可靠、经济的HF动物模型^[20]。因此，本研究选择阿霉素建立HF动物模型。炎症性疾病实质上参与内皮功能障碍的发展，最常见的心脏炎症相关细胞因子是TNF-α、白细胞介素、心肌营养因子-1等，这些蛋白质能够在炎症细胞与心肌细胞之间发挥作用，并与HF的进展程度成正比^[21-22]。研究表明，参麦注射液可以降低HF患者血清中的炎症因子水平，改善血管内皮细胞损伤导致的功能障碍，从而进一步保护心功能^[23]。本研究发现，模型组大鼠心肌组织IL-6、IL-1β、TNF-α和VCAM-1 mRNA表达量升高，HE染色显示心肌组织间存在明显的炎性细胞浸润情况，Masson染色显示心肌组织纤维化严重，给予不同剂量的参麦方治疗后，IL-6、IL-1β、TNF-α和VCAM-1 mRNA表达量降低，炎性细胞浸润情况得到改善，心肌纤维化减轻，提示参麦方具有较好的抗炎、抗纤维化作用，与上述文献报道类似。

本研究前期使用网络药理学预测得出参麦方防治HF的作用机制可能与HIF-1/VEGF信号通路相关，并且已有研究表明，提高大鼠心肌组织中的HIF-1和VEGF mRNA表达量能够显著促进血管新生并改善心功能^[24]。因此，本研究主要围绕此通路开展研究。HF的发展通常伴随血管生成受损，据报道，毛细血管稀疏、心肌组织氧合减少会导致HF发生^[25]。血管生成的关键调节因子VEGF由心肌细胞响应HIF-1α信号而产生，并且能够作用于内皮细胞上的VEGF受体2从而刺激血管生成^[26]。NO能够调节心肌功能，对心脏具有保护作用，过量的活性氧与NO生物利用度降低会导致心脏损伤^[27]。ET-1是内皮功能障碍的标志物，并且能够诱导促炎信号表达，抑制ET-1通路可以显著改善HF大鼠的血管舒缩内皮功能及存活率^[28]。既往研究显示，HIF-1/VEGF信号通路可以促进HF大鼠血管新生^[10]。曾玉玲等^[29]研究表明，参麦注射液能够通过上调VEGF、蛋白激酶B（AKT）等蛋白表达量，促进心肌梗死大鼠心肌血管新生。此外，有研究证实参麦注射液能够显著增加心肌缺血大鼠心脏血管CD31表达，并升高VEGF基因表达，促进血管生成，从而改善心肌缺血再灌注损伤后的心脏功能^[30]。本研究发现，模型组大鼠血清ET-1含量升高，NO含量降低，免疫组织化学CD31染色显示血管内皮受损，HIF-1α、VEGFA基因、蛋白含量下降，给予低、高剂量参麦方治疗后ET-1含量下降，NO含量升高，新生血管密度增加，HIF-1α、VEGFA基因、蛋白含量均呈现不同程度上调，其中低剂量参麦方对HIF-1α、VEGFA的上调作用更加明显，提示低剂量参麦方具有较好的促血管新生作用。推测参麦方可能通过促进血管新生，改善心肌组织供氧，抑制炎性因子表达，进而改善HF。

综上，参麦方能够抑制炎症反应，减轻心肌损伤，促进生理性血管新生，上调HIF-1α、VEGFA基因、蛋白表达，降低IL-1β、TNF-α等炎性因子表达，其作用机制可能与HIF-1/VEGF信号通路相关。但需要指出的是，考虑到不能明确参麦方与阳性对照药物治疗HF的作用机制是否相同，本研究并未设置阳性药组，且本研究的验证实验尚不够全面，只从某些方面阐释了血管新生，未来有待进一步探讨和补充。