慢性心力衰竭（CHF）是指由于各方面因素影响引发的心脏结构改变和（或）功能异常，累及心脏正常功能进而出现的心脏相关疾病^[1]。相关统计结果表明，近年来中国心血管疾病（CVD）的发病率逐年上升，每年CHF新发患者约50万例，发病率为0.7%~0.9%，且有较高的病死率，预后往往不良^[2]。随着中国人口老龄化的上升以及城市化进程推进，CHF已经成为中国CVD领域重要的公共卫生问题。

CHF患者多伴有水肿、腹水、胸水等症状，其主要原因是患者心脏输出量不足。随着相关研究的深入，揭示了心脏与肾脏在疾病发展过程中的关系，并以心肾综合征来命名此类疾病。肾脏功能不全可以归因于神经内分泌、氧化应激、血流动力学以及药物干预等因素^[3]。其主要原因在于肾素-血管紧张素-醛固酮（RASS）和交感神经系统（SNS）激活，心脏输出量降低，中心静脉压升高导致肾脏血管阻力增加与静脉压升高^[4]。CHF诱发的肾功能障碍使肾脏出现水钠潴留，引起细胞外液增加，从而加重心脏负荷，心脏功能进一步恶化。随着研究的不断深入，人们发现肾脏水钠潴留的机制是肾血流量减少，肾小球的滤过率降低，近曲小管和远曲小管对水的重吸收作用增强^[5]。研究并干预CHF水潴留的机制成为研究者当下着眼的重点之一。

中医认为CHF属于“胸痹”范畴，其基本病机在于“本虚标实”。病程之初，心脉受损导致的心气亏虚为虚证，气虚不利血行而致瘀血内停、阳虚水泛为实证^[6]。“心为五脏六腑之大主”作为脏腑学说中的代表，认为心脏节律有序，跳动有力从而推动血液的正常运行输布，保护脉道流畅。又因血脉共起于心，血脉同源，心、血、脉协同调节周身脏腑正常运行，故治疗CHF当以益气活血法为其中重要治则之一，由黄芪、丹参、三七、降香4味中药组成的益气活血方是益气活血法的代表方药。现代药理学研究证明，以上述4味中药为主的益气活血类方药具有改善CHF患者心肌供血、降低心肌耗氧量、促进血管新生、缓解水潴留症状等作用^[7]。大量临床研究表明，益气活血方治疗CHF疗效确切，能够改善CHF患者水潴留状态^[8-9]。但其起效机制尚不完全明确，围绕水通道蛋白角度开展的相关研究较为少见，故本研究以水通道蛋白为切入点探究益气活血方干预CHF水潴留的机制。

1 材料 1.1 实验动物

SPF清洁级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体质量（250±20）g，购自北京市华阜康实验动物有限公司[许可证号为SCXK（京）2014-0004]。本实验经天津中医药大学实验动物伦理委员会批准（编号：TCMLAEC20170043）。动物饲养于中国医学科学院放射医学研究所，12 h/12 h交替照明，室温维持22~24 ℃，自由摄食，饮水不限。实验中严格遵守减少、替代、优化的“3R原则”，给予充分人道主义关怀。

1.2 药物

益气活血方所用药物为颗粒剂，购自天津中医药大学第一附属医院国药堂，临床处方剂量为黄芪30 g（批号：1804002），丹参15 g（批号：18003095），降香10 g（批号：1810029），三七粉1.5 g（批号：1806026）。卡托普利片购自上海衡山药业有限公司，批号：国药准字H31021353。

1.3 试剂

氨基末端脑利钠肽前体（NT-proBNP）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，批号：P16860）；精氨酸加压素（AVP）ELISA试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，批号：P16468）；兔多抗GAPDH（杭州贤至生物有限公司，批号：AB-P-R001）；兔多抗水通道蛋白2（AQP2，美国博士德生物工程有限公司，批号：PB9474）；兔多抗pS256-AQP2（英国Abcam公司，批号：Ab111346）；兔多抗抗利尿激素V2型受体（V2R，英国Abcam公司，批号：Bs10014R）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗（武汉博士德，批号：BA1054）；RIPA裂解液（上海碧云天，批号：P0013B）；二喹啉甲酸（BCA）试剂盒（上海碧云天，批号：P0010）。

1.4 仪器

小动物超声仪Vevo2100及其配套的气体麻醉装置（型号：VS4153）；切片机（德国LEICA，型号：RM2235）；光镜（德国LEICA，型号：DM3000）；酶标仪（美国thermofisher公司，型号：mμlISKANMK3）；包埋系统（德国LEICA，型号：HistoCore）。

2 方法 2.1 CHF大鼠模型构建

将120只雄性SD适龄大鼠依照随机数字表法随机分为假手术组（10只）和造模组（110只），采用左侧冠状动脉前降至结扎法复制SD大鼠心肌梗死（MI）模型。假手术组于左侧冠状动脉前降支处穿线不结扎。模型组大鼠于左前降支（左心耳与肺动脉圆锥之间）穿过心肌后结扎，深1.5~2 mm，宽2~3 mm。结扎部位变为紫绀为结扎成功。

2.2 动物分组、造模、给药

造模组大鼠麻醉后死亡2只，术中死亡25只，术后4周内死亡10只。术后4周应用小动物超高分辨率超声系统评价造模是否成功[造模成功标准为射血分数（EF）＜50%]，成模率为68.49%，造模成功大鼠50只。造模成功大鼠随机分为模型组、卡托普利组及益气活血低、中、高剂量组，每组10只。中药方剂组成为黄芪、丹参、三七、降香，购自天津中医药大学第一附属医院，剂型为颗粒剂，剂量基于临床处方进行配比（黄芪30 g，丹参15 g，降香10 g，三七1.5 g），即成人每日服用56.5 g。根据成人临床剂量按照体表面积法计算灌胃剂量，卡托普利组为13.5 mg/（kg·d），益气活血低、中、高剂量组分别为2.5、5、10 g/（kg·d），给药组按照大鼠单次灌胃量1 mL/100 g加入蒸馏水制备成混悬液，模型组与假手术组每日给予等体积蒸馏水灌胃，每日1次，各组均给药干预8周。干预期间各组大鼠均未出现死亡。

2.3 观测指标与检测方法 2.3.1 心功能超声检测

分别于造模4周后及给药8周后，对实验对象进行超声检测，对其心功能进行评价。左侧胸部剃毛备皮，将大鼠置于麻醉盒内采用异氟烷进行麻醉，术中行低浓度异氟烷麻醉。充分固定大鼠头部和四肢，胸部涂抹耦合剂。在超声检查时选择探头MS-250，采集M-Mode图像，计算相关参数。每只大鼠检测3个心动周期，取平均值。

2.3.2 大鼠血清NT-proBNP、AVP检测

依照ELISA实验方法，将大鼠血清样本稀释200倍后，设置标准品孔与样本孔，每孔添加标准品或待测样本100 μL，混匀后敷上板贴37 ℃孵育2 h。依次加入生物素标记抗体工作液100 μL，37 ℃孵育1 h。依次加入HRP标记亲和素工作液100 μL，37 ℃孵育1 h。每孔加入底物溶液90 μL，37 ℃避光显色15~30 min。后加入终止溶液，每孔50 μL，终止反应。5 min内采用酶标仪在450 nm波长测量各孔光密度值（A值）。

2.3.3 苏木精-伊红（HE）染色观察大鼠心肌组织及肾脏组织病理变化

将大鼠心脏及肾脏组织固定于10%甲醛溶液中，经梯度乙醇脱水、透明、浸蜡、包埋等步骤制作石蜡切片。后经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、苏木素染核、分化、流水冲洗后伊红复染、梯度酒精脱水、透明、树脂胶封片，光学显微镜下观察结果并拍照。

2.3.4 免疫组织化学法观察大鼠AQP2、pS256-AQP2位置及分布

假手术组、模型组、卡托普利组及益气活血各剂量组分别随机抽取6个肾脏样本石蜡切片脱蜡至水，抗原修复液修复组织，待其降至室温后取出玻片，采用pH=7.4的磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗3遍，3%双氧水（H₂O₂）溶液阻断内源性酶原，pH=7.4的PBS冲洗3遍，滴加稀释山羊血清，室温下封闭30 min，滴加稀释后一抗AQP2，稀释倍数：GAPDH为1 000倍、AQP为21 000倍、pS256-AQP为21 000倍，4 ℃湿盒环境下孵育过夜。加酶标二抗，PBS充分冲洗，每次3 min，共3次。对切片进行充分干燥后滴加HRP标记二抗，50 000倍稀释，37 ℃孵育30 min。各切片滴加3，3’-二氨基联苯胺（DAB）显色液，光镜下观察切片染色情况，棕黄色为阳性表现，颜色明显时需要进行充分冲洗。苏木素复染，分化，PBS冲洗返蓝。结束后放入至梯度乙醇脱水，透明，各2 min，将切片自然干燥。通过树脂封片，400倍光镜观察，选取5个高倍视野采集图片，然后输入到ImageJ软件中进行分析，确定阳性表达面积及均值。

2.3.5 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测大鼠肾脏AQP2、pS256-AQP2、V2R蛋白表达情况

称取洗净后的肾脏样本20 mg，充分研磨后加入磷酸酶抑制剂进行裂解，采用BCA试剂盒对蛋白含量进行检测。待其稀释、变性后开展凝胶电泳操作，且根据要求进行转膜处理。随后震荡1 h，向其中加入一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次后加入二抗，随后室温环境孵育1 h，洗膜后进行电化学发光（ECL）显影操作，使用ImageJ软件进行分析确定目的蛋白表达水平。

2.4 统计学方法

采用SPSS 21.0处理实验数据，对各组数据进行正态性检验后，数据符合正态分布时，组间比较采用单因素方差分析，符合方差齐性采用LSD检验，方差不齐采用Dunnett’s T3检验；数据不符合正态分布或数据为等级资料则采用非参数检验（Kruskal-Wallis秩和检验）。各组间比较采用方差分析中均数的两两比较，数据均以均数±标准差（x±s）表示。P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 大鼠一般状态

假手术组大鼠饮食正常，毛色顺滑，体质量正常增加，活动能力正常。模型组大鼠精神不振，进食量下降，毛发光泽明显下降，同时出现肢体水肿现象。各给药组大鼠一般状态均有不同程度改善，饮食状况尚可，毛发有光泽，活动能力增强，四肢水肿不明显。

3.2 对CHF大鼠心脏质量指数（HWI）与左心室质量指数（LVMI）的影响

大鼠HWI结果提示，与假手术组比较，模型组大鼠HWI升高，差异具有统计学意义（P < 0.01）；与模型组比较，卡托普利组及益气活血中、高剂量组HWI均可见不同程度降低，差异有统计学意义（P < 0.01）。大鼠LVMI结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠LVMI升高，差异有统计学意义（P < 0.01）；与模型组比较，各给药组均能不同程度降低LVMI水平，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表 1。

3.3 对CHF大鼠EF的影响

造模后4周采用小动物超声成像技术测定其心脏左心室功能。结果表明，与假手术组比较，其余各组大鼠左心室扩张明显，室壁运动水平下降，各组大鼠EF均可见不同程度降低，差异有统计学意义（P < 0.01）。在药物干预8周后再次测定大鼠左心室功能，结果表明，与假手术组比较，模型组大鼠室壁运动能力减弱，心室活动度降低，EF仍较低，差异有统计学意义（P < 0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠EF升高，差异有统计学意义（P < 0.01）。给药8周后，卡托普利组及益气活血低、中、高剂量组大鼠EF较术后4周均有不同程度提升，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表 2。

3.4 对CHF大鼠血清NT-proBNP的影响

大鼠血清NT-proBNP结果表明，与假手术组比较，造模后4周各组大鼠血清NT-proBNP升高，差异有统计学意义（P < 0.01）。给药干预8周后，模型组及各给药组大鼠血清NT-proBNP水平持续上升（P < 0.01）；与模型组比较，卡托普利组及益气活血中、高剂量组能够降低血清NT-proBNP水平，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表 3。

3.5 对CHF大鼠心脏、肾脏组织影响 3.5.1 心脏组织

HE染色后发现，假手术组大鼠心肌细胞形态完整，排列整齐，对应的细胞核位置正常，未见明显细胞水肿，未见炎症细胞。模型组大鼠心肌形态不完整，存在较多肿大及坏死心肌细胞，可见明显炎性细胞浸润及心肌纤维化现象。与模型组比较，卡托普利组及益气活血中、高剂量组心肌细胞完整性、心肌细胞肿大及坏死、炎症细胞浸润及心肌纤维化情况均有不同程度改善。益气活血低剂量组改善效果不明显。见图 1。

3.5.2 肾脏组织

HE染色后发现，假手术组大鼠肾小管上皮细胞形态规则，肾小管管腔宽度正常。模型组大鼠肾小管上皮细胞排列紊乱，细胞水肿明显，肾小管管腔明显狭窄，伴有少量炎性细胞及纤维化组织。卡托普利组及益气活血中、高剂量组大鼠肾小管上皮细胞形态未见明显变化，水肿不明显，管腔狭窄程度较模型组改善，未见炎症细胞及纤维化组织。与模型组比较，益气活血低剂量组未见明显变化。见图 2。

3.6 对CHF大鼠肾脏组织AQP2、pS256-AQP2的影响 3.6.1 AQP2

免疫组织化学法统计阳性面积结果显示，各组大鼠AQP2多见于肾脏集合管部位。与假手术组比较，模型组大鼠AQP2阳性面积增加，差异有统计学意义（P < 0.01）；与模型组比较，卡托普利组及益气活血各剂量组大鼠AQP2阳性面积减少，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见图 3、图 4。

3.6.2 pS256-AQP2

免疫组织化学法统计阳性面积结果显示，各组大鼠肾脏pS256-AQP2主要表达于肾脏集合管上皮细胞附近。与假手术组比较，模型组大鼠阳性面积增加，差异有统计学意义（P < 0.01）；与模型组比较，卡托普利组及益气活血各剂量组大鼠阳性面积减少，差异有统计学意义（P < 0.01）。见图 5、图 6。

3.7 对CHF大鼠AVP、V2R、AQP2、pS256-AQP2水平的影响 3.7.1 AVP

采用ELISA法检测大鼠血清中AVP水平变化，结果表明，与假手术组比较，模型组大鼠血清AVP水平上升，差异有统计学意义（P < 0.01）；与模型组比较，卡托普利组及益气活血中、高剂量组大鼠血清AVP水平下降，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表 4。

3.7.2 V2R

采用Western Blot法检测大鼠肾脏V2R蛋白水平，结果表明，与假手术组比较，模型组大鼠肾脏V2R表达水平增加，差异有统计学意义（P < 0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠肾脏V2R表达水平降低，差异有统计学意义（P < 0.01）。见图 7。

3.7.3 AQP2

采用Western Blot法检测大鼠肾脏AQP2表达水平，结果表明，与假手术组比较，模型组大鼠肾脏AQP2表达水平上升，差异有统计学意义（P < 0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠AQP2表达水平降低，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见图 8。

3.7.4 pS256-AQP2

采用Western Blot法检测大鼠肾脏pS256-AQP2表达水平，结果表明，与假手术组比较，模型组大鼠肾脏pS256-AQP2表达水平上升，差异有统计学意义（P < 0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠肾脏pS256-AQP2表达水平降低，差异有统计学意义（P < 0.01）。见图 9。

4 讨论

祁含章等^[10]与施琦等^[11]就CVD的病理机制进行深入分析，提出了“血-脉-心-神”一体观的治疗理念，为CHF患者的治疗提供了新思路。该理论通过阴阳学说、脏腑、藏象学说相结合，全面系统地分析了疾病病理变化过程中的病机变化^[12]。《素问·痿论》中提到“心主身之血脉”，即心脏主宰全身血液循环。心脏通过推动心气来促进血液流动，血液携带营养物质滋养四肢百骸，而脉络乃血液运行通道，脉道通畅则血液循环顺畅。《素问·脉要精微论》中提到：“夫脉者，血之府也。”意味着全身的血液和营气通过脉络源源不断运行，形成一个周身循环的通道。心气的推动、温煦和收摄作用使心脏能够有节律地搏动。脉管的舒张和收缩功能正常，脉道畅通，血液顺畅流动，从而滋养脏腑。如果心脏受损，心气不足，无法推动血液流动，气血不足导致血液凝滞或血液流动缓慢，无法滋养心脏，进一步导致脉络舒缩无序，心脏受损加重，心脏功能减弱，形成恶性循环。神的稳定依赖于血液滋养，如果血脉失调，心失濡养，心脏功能受损，造成心神失养，思维和意识活动便会随之减弱。反之，神志活动紊乱，五脏遭受过度刺激，导致气血紊乱，损伤血脉，心体与心神共同受病，出现焦虑、抑郁、失眠和烦躁等症状。

心力衰竭日久，五脏皆损，正气损耗，外邪易侵，病情易于反复，久病难治，阴阳两虚。《推求师意》中云：“及乎水火既济，全在阴精上承，以安其神；阳气下藏，以安其志。”另有云“五脏之伤，穷必及肾”，心本乎于肾，肾为先天之本，有资助他脏之功。肾气亏虚，不能上资于心，则心体失荣，君火失用。脾能化生水谷，滋养他脏，脾失健运，化生乏源，心体失养，痰饮内聚。水湿、痰饮、瘀血等病理产物上犯上焦，阻碍气化，出现水肿、呼吸困难等症状。故通过益气活血之法，在促进血管通畅、修复损伤、滋养心脏的同时改善CHF水潴留情况，符合中医对CHF病因病机认识^[13]。

益气活血方为CHF临床治疗的常用方剂之一，其主要组分为黄芪、丹参、三七、降香，其中黄芪为君，丹参为臣，降香、三七为佐使。黄芪补益心气，在治疗时可以行血祛瘀；丹参、三七促进血液运行，同时清心除烦，对心神具有一定滋养作用；降香化瘀理气，益气活血效果显著。现代药理学研究发现，黄芪多糖干预后，小鼠同型半胱氨酸（HCY）、核转录因子-κB（NF-κB）、D-二聚体水平明显降低^[14]。黄芪甲苷对大鼠肾脏转化生长因子-β1（TGF-β1）的表达水平具有一定调节作用，同时还可以促进结缔组织生长因子mRNA的表达，能够有效抑制CHF过程中的肾脏衰竭^[15]。相关实验研究结果表明，三七总皂苷对CHF大鼠血清中的炎症具有一定抑制作用，有效减轻了心肌细胞的凋亡水平^[16]。降香的多种组分对心肌具有保护作用，同时还能够发挥良好的抗氧化、抗凝作用，干预效果显著^[16]。

AQP2为一种关键的水通道蛋白，和机体内的水液代谢密切相关。其主要分布于哺乳动物的细胞膜上，可以有效调节水分运输过程。研究表明，AQP2在肾脏的集合管中广泛表达，集合管对机体的水平衡状态具有调节作用，而水分的重吸收则主要与AVP存在相关性^[17]。研究发现AVP对血浆渗透压存在一定调节作用，其主要在神经垂体中储存与释放，在机体的水液代谢中发挥多方面调节作用，并通过抗利尿激素V2R在收集导管中发挥相关调节作用。AVP对AQP2在囊泡内的移位起到促进作用。此外，其还可以增加集合管主细胞对水的通透性，提高渗透压^[18]。在V2R介导的腺苷酸环化酶（ACs）刺激、环磷酸腺苷（cAMP）升高和蛋白激酶A（PKA）激活条件下，AQP2水平增加^[19]。研究发现CHF初期阶段，心脏功能下降后，心脏会出现一系列代偿性变化，从而确保心输出量正常。研究发现肾素-血管紧张素-醛固酮（RASS）系统激活为主要表现，这种系统激活会导致肾小管的远曲小管对钠离子的通透性发生改变，引起体液潴留。此外，CHF患者的心输出量下降，促进AVP分泌，AVP浓度增加后，全身血管阻力随之增加，而心输出量会出现一定程度下降^[20]。AVP对肾脏集合管主细胞中的V2R具有一定刺激作用，进而提高水重吸收水平，加重水潴留状态^[21]。卡托普利可以抑制正常大鼠肾内髓质AQP2 mRNA的表达，同时促进肾脏内部的AQP2经尿液排出体外。故本研究采用卡托普利作为阳性药物进行干预^[22]。本研究结果表明，采用益气活血方治疗后，大鼠血清AVP水平明显下降，肾脏中V2R受体水平降低，从而降低了肾脏对水的重吸收作用，改善了CHF大鼠的水潴留情况，且与应用卡托普利相比疗效相当。

研究发现，AQP2羧基末端的丝氨酸256位点是PKA磷酸化的特异性位点，可以促进AQP2聚合至细胞表面。实验研究表明，电子显微镜下观察到pS256-AQP2在细胞膜和细胞内的小泡中均存在一定表达，也反映出在正常AVP表达水平下，AQP2同样在丝氨酸256位点发生磷酸化，且借此发挥相关作用^[23]。由此也反映出丝氨酸256位点对于AQP2发挥其功能具有显著影响，也决定了AQP2的转运结果。另有研究表明，益气活血类方药能够有效改善CHF大鼠心脏功能，降低肾脏组织AQP2表达水平^[24]。应用芪苈强心胶囊同样能够改善CHF大鼠的心功能及AQP2表达水平^[25]。对比上述研究，本研究结果明确了益气活血方中黄芪、丹参、降香、三七配伍对于CHF大鼠肾脏功能障碍的调节作用。益气活血方对CHF大鼠进行干预后，其肾脏AQP2、pS256-AQP2水平下降，明确了益气活血方的干预可以对AQP2在肾脏的表达进行有效调节，其机制可能是通过降低磷酸化水平促使其转移至肾集合管细胞膜，从而有效降低水的重吸收水平。本研究为应用“血-脉-心-神”一体观理论辨治CHF提供了证据支持，同时为益气活血法的方药治疗CHF提供了新的潜在通路及干预靶点。