中药是在中医药理论与临床经验指导下的用于防治疾病及医疗保健的药物^[1]，经受了医疗实践的长期检验，疗效确凿可靠，深受人们的信赖与认可。然而自中药应用以来，其真伪和品质问题一直是相关从业者必须面对的难题，不仅关系药材质量与用药安全，还涉及整个中医药行业的声誉及发展。

传统的中药鉴定包括基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定，主要通过中药的外观形态、显微结构及特征化学成分进行鉴定^[2]。然而，药材的性状特征和化学成分容易受到生长环境和炮制加工的影响，为鉴定工作带来了较大干扰。此外，以性状和显微为代表的鉴定方法存在一定主观性，难以满足中药鉴定的实际需求。因此，迫切需要发掘其他方法提高中药鉴定的准确性与客观性。而分子生物学的发展，有效弥补了传统的中药鉴定方法准确性不足和主观性较强的缺点。使用分子鉴定的方法，可以规避样品形态、加工炮制过程对鉴定的影响^[3]。

1 中药分子鉴定现状

在中药鉴定领域，分子鉴定方法因其独特的精准性和稳定性日益受到重视。DNA作为遗传信息的直接载体，为中药鉴定提供了坚实的分子基础。生物遗传多样性使得研究者们能够在种属水平对中药进行准确鉴定。此外，DNA分子鉴定具有显著的稳定性与可靠性。这种稳定性源于DNA分子不容易受到外界因素、生物体不同发育阶段以及不同器官组织差异的影响。这一特性确保了鉴定结果的准确可靠^[4]。自2010年蕲蛇和乌梢蛇的分子鉴定方法被收录于《中华人民共和国药典》以来，截至2020年版《中华人民共和国药典》，已经陆续收录金钱白花蛇、霍山石斛和川贝母的DNA分子鉴定方法^[5]。

目前常用的DNA分子鉴定技术包括限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）、DNA测序法等多种技术^[4]。与其他方法相比，DNA测序能够提供更高的分辨率和灵敏度。它不仅能够提供特定位点的信息，还能够提供完整的DNA区域信息，使研究人员能够更加全面准确地了解样本的遗传信息。作为一种高效且全面的分子鉴定方法，DNA测序法逐渐成为中药分子鉴定领域的重要手段。DNA测序法分为聚合酶链式反应（PCR）扩增子测序和PCR-free两种类型。其中，PCR扩增子测序技术作为一种高度靶向的方法，允许研究人员分析特定基因组区域的遗传变异。通过对特定基因片段的PCR产物或捕获片段进行测序分析，如COI、trnL和16S rRNA等基因片段，可以用于广泛的研究领域。随着测序技术的不断发展，研究人员可以根据不同的研究目的选择不同的测序技术，以满足鉴定深度和精度的需求。目前，较为前沿的方法是扩增子测序技术与下一代测序技术相结合，即DNA宏条形码技术^[6]。

2 利用扩增子测序技术实现生物鉴定的优势 2.1 从高度降解样本中检测生物成分

环境DNA（eDNA）是指可以直接从环境样品中提取到的DNA片段总和，其中蕴含丰富的物种信息。然而，由于多种环境因素的影响，部分物种的DNA会产生降解，这给监测工作带来了挑战。对于扩增子测序而言，使用适当长度的分子标记可以成功扩增降解的DNA片段^[7]。此外，扩增子测序技术能够在一次反应中生成大量扩增子片段序列，这些序列来自于不同的物种，因此能够同时识别大型混合群落中的不同物种^[8-9]。目前，扩增子测序已经被证实在检测eDNA中微量降解物种时可靠且灵敏^[10]。在Lynggaard等^[11]的研究中，使用定制空气采样器收集空气中的eDNA，分别扩增所提取的eDNA中的16S rRNA及12S rRNA两个基因片段，检测到鸟类、哺乳动物、鱼类和两栖类群共计64个。多项研究结果显示了扩增子测序在鉴定高度降解样本中生物成分的能力，可以获得更全面、多维度的鉴定信息。

2.2 对复杂混合样本进行监测

当需要对大量样本进行检测时，抽样成为一个重要问题。对每个样本逐一进行鉴定通常不切实际，如果抽样不足，则可能会影响鉴定结果的可靠性。为解决这个问题，可以将扩增子测序技术与混池测序的策略相结合，对大量样本进行处理，从而实现更为高效的鉴定。Milla等^[12]对澳大利亚东部和西部6个生物区的15个蜂蜜样本进行扩增子测序研究，以探究花蜜来源及蜜蜂的饮食偏好性；Batovska等^[13]对昆虫池中的昆虫样本进行扩增子测序，以检测农业害虫的物种种类，并提出了一种用于检测批量陷阱捕获的害虫的非破坏性方案。通过混池测序策略，研究人员能够对样本内部的生物多样性进行检测，实现高通量、全面、快速的生物样本分析和鉴定。

3 扩增子测序技术在中药材及中成药中的应用

扩增子测序技术在中药分子鉴定领域展现出显著优势。该技术聚焦于特定的基因片段，通过深入发掘序列差异，为中药的准确鉴定提供了强有力的分子工具。特别是在多基原中药材和中成药的鉴定中，扩增子测序的优势尤为突出。扩增子测序技术的鉴定结果不仅能够有效鉴定中药基原，也为建立中药材DNA数据库与开展大规模中药材溯源提供了可能。对中药材DNA进行扩增子测序并建立数据库，能够更加全面地理解中药材的遗传多样性，为确保中药的质量与真实性提供有力支持。

3.1 扩增子测序技术在中药材基原控制中的应用

中国中药材资源丰富，由于地域差异导致了不同的用药习惯，这使得中药材的来源复杂多变^[14]，尤其对于一些多基原药材及复杂动物药材，市场基原更是复杂且难以准确鉴定。通过选择合适的基因片段，扩增子测序技术还可以实现种水平鉴定。此外，大批量中药材的鉴定是中药质量监管过程中的重要问题，在实际监管过程中，需要考虑抽样问题。结合混池测序等策略，可以对大批量样本进行鉴定，从而对中药材来源进行分析，为中药材的质量和基原控制提供了新工具。

对于多基原中药材而言，药材基原的控制至关重要。国家药品监督管理局在《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》（2021年第16号）中规定，来源如为多基原中药材，应固定一个基原，不同基原的中药材不可以相互混用。不同基原正品可能具有不同价格，这也许会导致药材混用的情况发生。此外，不同基原之间的药效成分和活性也可能存在一定差异。如果不能有效控制药材基原，可能对药效产生一定的影响。因此，准确识别药材基原对于指导临床用药和市场基原控制具有重要意义。Xu等^[15]共收集了4 580个不同基原的市售桑螵蛸样本，通过对COI区域进行扩增子测序并开展物种界定，发现市售桑螵蛸药材中，除了《中华人民共和国药典》规定的基原中华大刀螳（Tenodera sinensis）和巨斧螳螂（Hierodula patellifera）外，还额外存在狭翅刀螳（Tenodera angustipennis）。Yang等^[16]基于芍药、川赤芍叶绿体基因组开发专属性DNA微型条形码，通过扩增子测序技术考察其对多基原药材混合物的鉴定能力，并成功应用于中成药脑血栓片中，实现对其中所含赤芍药材的定性与定量鉴定。该研究为中药产品中多基原中药材的物种控制提供了研究实例。

对于天然野生药物，存在相似形态特征和同域分布的多个物种或品种，这可能导致同一批药材中存在多个基原，影响临床用药的有效性与安全性。以天然野生药物广地龙为例，Xing等^[17]对COI基因进行扩增子测序，通过结合DNA迷你条形码技术、DNA宏条形码技术和物种界定方法，提出了一种新型基原多样性评估策略。研究发现除正品广地龙外，在所收集的19个采样点的5 376个野生广地龙样品中，结合形态学及线粒体基因组学证据，有其他8个分类操作单元作为伪品存在，并且发现即使是广地龙的不同遗传亚组，其化学成分与生物活性也存在显著差异。通过调查后续2 796份地龙饮片，发现可以通过固定地理产区获得相对稳定的远盲蚓属Amynthas物种组成，进而稳定药材质量。这项研究说明扩增子测序技术在野生药材鉴定中具有独特优势，通过大批量样本混合物的鉴定，能够精确检测物种基原，确保市售中药基原的可控性。此外，壁虎作为一种名贵野生中药材，由于其自然栖息地的破坏和滥捕，导致市场供不应求，常有其他物种进行掺假，严重影响用药安全。Su等^[18]收集了正品壁虎和伪品壁虎共269份样本，对COI区域进行了扩增子测序，并开发了壁虎的专属迷你条形码，用于市售药材和中成药中壁虎基原的准确鉴定。

3.2 扩增子测序技术在中成药质量控制中的应用

中成药是在中医药理论指导下，通过医学和药学研究，获得国家药品监督管理部门批准的中药制剂，其制备过程依据中医处方，使用中药饮片作为原料，按照规定的生产工艺和质量标准制成^[19]。随着医疗卫生不断发展，中成药种类不断增加，各种基于传统药方的新剂型也相继问世^[20]。但根据2022年国家药品抽检结果显示，发现多种中成药仍存在伪品混入情况，乳康系列制剂中发现了部分批次样品可能存在以湖北贝母替代浙贝母投料的现象，参麦颗粒、人参健脾丸、更年宁和男宝胶囊均在部分批次样品中检测出拟人参皂苷F11，提示可能存在西洋参掺入人参投料的情况^[21]。中成药作为一个复杂的混合样本体系，每一种药材都可能对整体的药效产生影响，因此进行全面的物种鉴定是确保其质量控制的核心环节。然而，中药制品和中成药在加工炮制过程中，药材DNA和化学成分可能受到不同程度影响，这为鉴定工作带来了挑战。在这一背景下，扩增子测序技术展现出了独特优势。通过选择较短的扩增子，并结合深度测序技术，能够有效检测丰度相对较低的序列，实现中成药、中药材的全面精确鉴定^[22]。

自2005年开始，罗氏公司开发454测序系统，标志着测序技术跨入高通量并行测序时代^[23]。研究人员也开始将高通量测序技术与扩增子测序技术结合，用于中成药的鉴定。2012年，Coghlan等^[24]利用trnL和16S rRNA两个基因片段对15种进口中药制剂进行成分分析，鉴定出了具有潜在毒性的细辛属和麻黄属植物、亚洲高鼻羚羊和黑熊等濒危动物。该研究首次将扩增子测序技术结合NGS技术应用于中成药体系下，是中成药检验的一个高效方法，有助于监察中药制剂的合法性与安全性。2018年，石林春等^[25]构建了如意金黄散DNA条形码鉴定数据库，通过对ITS2基因片段进行扩增子测序，对3个批次的如意金黄散成分进行了检验，最终检测到除厚朴外的全部处方成分，且鉴定到苍术药材的混伪品朝鲜苍术和天南星药材的混伪品虎掌南星，提示如意金黄散临床使用的有效性与安全性存在潜在风险。

随着测序技术的不断发展，研究人员不断将扩增子测序技术与新的测序技术相结合，用于中成药的鉴定。2018年，Xin等通过对ITS2和psbA-trnH两个基因片段进行扩增，并结合单分子实时测序技术，成功检测了九味羌活丸中的多种成分。其研究证明了单分子实时测序技术的可重复性、可靠性和敏感性，可以有效地检测中成药中的物种。此外，单分子实时测序技术的误差并未影响对多种处方物种和几种掺假物/污染物的识别能力，这证明了该技术在中成药检测中的应用潜力。

除了结合不同的测序技术，还可以将扩增子测序技术与其他鉴定方法相结合，从而获得更加全面可靠的检测结果。2023年，Mück等^[26]利用nrITS1和nrITS2两个基因片段及高效薄层色谱（HPTLC）对茯苓桂枝丸和膈下逐瘀汤进行鉴定，检测出了大多数预期成分。此外，扩增子测序能够在产品中检测到规定外的物种，如东当归等，这可能意味着市售样本中存在一定比例的掺伪或污染。扩增子测序技术和HPTLC的结合使用，既提供了对每个样品中物种多样性的概览，又能通过色谱法实现对不同成分的具体检测。

4 扩增子测序技术在中药鉴定中的关键技术步骤 4.1 样本DNA提取

DNA提取的成功与否直接影响了后续鉴定工作的顺利进行。提取样本基因组DNA时，应注意保证样本的真实性，防止外源DNA污染。目前常用的DNA提取方法有十二烷基硫酸钠（SDS）法^[27-28]、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法^[29-30]和试剂盒法^[31-32]等。然而中药来源复杂，包括植物的根、茎、叶、花、果实以及动物的器官、骨骼、皮毛、分泌物等。这些不同种类的中药含有多样化的化学成分，可能对DNA的提取产生影响。并且多数中药在使用前经历多道炮制加工流程，在这些过程中，DNA会发生不同程度的降解，而在中成药的制备过程中，药材经受高温、强酸强碱环境及反复冻融，有些甚至以提取物入药，这些加工步骤同样对DNA的完整性产生影响。Lo等^[33]研究发现，当药材粉末煮沸120 min后，DNA发生降解，无法观察到200 bp的目标片段，因此较长的片段在这些样本中难以被扩增。此外，中成药通常包含一些辅料以使药材成型，这些辅料同样可能对DNA的提取产生一定影响。因此，在进行实验时，需要根据具体样品的特性选择合适的DNA提取方法，并进行有针对性的优化。例如，Xu^[34]等使用多糖多酚试剂盒对富含挥发油的玫瑰进行基因组DNA提取；夏玲等^[35]对甜瓜半粒干种子的DNA提取方法进行优化，发现优化改良的CTAB法提取效果明显更优。程春松等^[36]发现淀粉的存在会影响CTAB法提取DNA的效率，同时指出通过甲醇沉淀可以去除淀粉对DNA提取的不利影响。

4.2 引物选择

引物选择是影响扩增子测序数据分析结果与实际样本是否相同的重要因素。一方面所选择的引物可能对某些特定物种的扩增具有一定偏好性；另一方面引物区域的差异度可能导致物种扩增失败，从而影响最后样本的鉴定结果^[37]。在研究中，孙晶莹^[38]发现PCR引物对扩增子测序的物种检测和定量结果存着显著影响。Pi?觡ol等^[39]和Deagle等^[40]均认为引物的偏好性在很大程度上影响了PCR扩增，并进一步影响测序数据结果。Pi?觡ol等^[41]的研究结果再次证实了不同引物的选择会影响高通量测序的定量结果。因此，引物的选择会影响扩增子测序在中药中的鉴定结果。由于引物存在偏好性，单一的引物无法完全反映复杂样本中的物种多样性，因此，为提高鉴定准确性，对同一实验对象可以采用多个标记联合的方法。例如，Bohmann等^[42]和Alberdi等^[43]采用16S和COI共4个片段联合对蝙蝠食性进行研究；Frigerio等^[44]通过联合使用ITS2和psbA-trnH两个基因片段，对花草茶的植物基原进行鉴定。

目前，对引物选择最好的处理方法是进行引物评估工作，优选偏好性较小的引物进行扩增子测序及后续下游分析。例如，Elbrecht等^[45]在鉴定节肢动物时，比较了多对引物的扩增情况，从而优选出了较好的基因片段。“电子PCR”通过引入条形码覆盖率（Bc）和条形码特异性（Bs）两个概念，分别测量引物的保守性和扩增区域区分分类群的能力。Bellemain等^[46]与Ficetola等^[47]通过电子PCR手段模拟评估18S rDNA扩增子对线虫群落特征的描述。

4.3 测序平台选择

近年来，随着测序技术的不断发展，不同长度的扩增子均可以进行测序。目前常用的测序平台包括454、Illumina、PacBio（Pacific Biosciences）、Nanopore（Oxford Nanopore Technologies）和ABI的SOLiD等。目前二代测序Illumina平台允许对500 bp左右的扩增子片段进行测序，过长则会影响测序质量，出现错误^[48]。PacBio和ONT可以产生长度超过20 kb的结果，但是PacBio在单个测序读数上的错误率相对较高，尤其是在读长的末端。虽然多次测序可以提高准确性，但在某些研究中可能仍需要更高的覆盖度，而ONT测序无法为宏条形码提供足够的读取质量^[49-51]。在选择测序平台时，需要考虑PCR产物片段的长短、数据量、适用范围、所需时间及成本等因素，以确保选择合适的测序平台来满足实验需求。

4.4 数据处理过程

目前，随着测序技术的不断发展，扩增子测序技术及下游分析逐渐形成一套较为成熟的流程^[52]，主要包括序列质量过滤、聚类、分类分配等步骤，主流的扩增子分析软件包括Usearch^[53-54]、QIIME^[55]及QIIME2^[56]等。上述软件在近年来被广泛引用，涵盖了扩增子数据分析的全套流程，能够将复杂的测序数据转化为直观的统计表。这些生物多样性分析软件主要设计用于微生物学或生态学领域的群落研究，而在中药领域的应用中，由于分析对象的物种丰富程度和数据量等与其他领域存在差异，因此对于数据分析的具体流程和参数设置需要根据具体的研究情况进行调整。

经过聚类生成一致性序列后，通过与数据库中的物种序列进行比对，进行物种鉴定。目前，不同领域已经有多个较为完善的数据库可供使用，这些数据库的存在为生态领域的数据分析工作带来了极大便利。在中药学领域，鉴定工作同样依赖于GenBank、BOLD等公共数据平台。然而，这些数据库的覆盖范围仍然存在一定局限性，例如植物学参考数据库信息的可用性略低于脊椎动物数据^[57]，这可能对植物中药的鉴定造成一定影响。一些伪品药材及近缘动植物可能未在数据库中得到完全覆盖。由于缺乏参考数据，这可能会对扩增子测序的下游分类分配和物种确定造成一定阻碍。因此，进行中药相关动植物基因序列的获取和整理工作至关重要，这些基因序列不仅可以丰富数据库、提高参考数据的覆盖率，还能够为扩增子测序技术在中药领域的应用提供更可靠的支持和保障。

5 结语和展望

对中药材及中成药中的物种基原进行鉴定，不仅是生产质量评价与合理临床运用的潜在要求，也是保证中药研究科学性与真实性的前提条件。扩增子测序技术作为一种新兴的分子鉴定技术，具有快速准确检测样本中包含的所有生物体的优势，其适用范围广、成本低廉、灵敏度高。多篇研究表明，扩增子测序技术可以有效鉴定中药粉末混合物及中成药、中药材基原，填补了传统鉴定技术在该方面的空缺。虽然仍存在DNA降解和PCR偏好性等方面的问题，但是通过比对多种提取方法、进行引物筛选和多个标志物联用等技术，可以在很大程度上减小实验过程对鉴定结果的影响。

近年来，为了更好地使用扩增子测序技术对中药材进行鉴定，中国陆续建立了中药材DNA条形码数据库、药用植物DNA条形码数据库和叶绿体基因组信息资源数据库等。这些数据库的建立，使得覆盖的物种逐渐增加，显著提升了DNA分子鉴定技术在中药及其制品中的应用效率，有效弥补了传统鉴定方法的不足。此外，随着生物科技的不断进步，多种新技术不断涌现，为生物学和医学研究提供了新的可能性。在生物信息学领域，人工智能和机器学习的发展使得数据处理与分析变得更加高效和精准，为不同领域的研究及应用提供了强有力支持。通过将多种技术相结合，研究人员可以逐步解决中药资源面临的各种问题，为中药材的鉴定与研究开辟新的道路。

未来，通过将现代科技与传统中药鉴定技术相结合，能够更好地对中药掺混进行鉴定，为中药及其相关产品的质量提供有力保障，推动中医药的现代化发展。