糖尿病肾病(DN)是2型糖尿病(T2DM)患者的肾脏常见并发症，也是导致终末期肾脏病(ESRD)的常见原因^[1]。DN发病机制较为复杂，高血糖状态、免疫反应、氧化应激等因素可能参与疾病的发生过程。其中，炎症细胞的聚集与炎症因子的释放是疾病发生的重要因素。现代医学治疗DN主要以肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)抑制剂、钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂等。近些年，盐皮质激素受体(MR)抑制剂如非奈利酮的研发，为DN的治疗提供了宝贵的新方案。尽管如此，当前治疗药物多为单靶点，且部分药物存在不可避免的不良反应，中医药干预显示出多角度和多通道的特性，在延缓DN疾病进展方面发挥着越来越重要的作用^[2]。

中医古籍对DN已有相关记载，如《圣济总录》：“小便利多，腿胫消瘦，骨节酸疼，故名消肾”。DN病机总属本虚标实，病初多表现为脾肾亏虚、气阴两虚，病久则在本虚基础上形成湿、痰、瘀、毒等病理产物，损伤肾络^[3]。全国老中医药专家学术经验继承工作指导教师、天津市名中医曹式丽教授，在长期临床实践中，以“肾络瘀阻”作为DN的核心病机，创立“辛畅通络”法，针对DN本虚标实的特点，选用辛香、辛咸等药物以祛邪通络，辛甘、辛温等药物以养脏和络，临床疗效显著^[4-5]。肾苏合剂作为“辛畅通络”法的代表方剂，由水蛭10 g，黄芪30 g，细辛3 g，当归15 g，桃仁10 g组成^[6]。全方以辛药为主，黄芪甘温补气，当归甘温养血，细辛、桃仁散肾络沉寒，除络中瘀毒，地龙引药入络，搜风剔邪。实验研究表明，肾苏合剂在保护、修复肾小球，维持其结构和功能完整等方面，效果显著^[7]。本文运用网络药理学结合分子对接技术，探讨肾苏合剂治疗DN可能的靶点和通路，为其临床使用提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 分析肾苏合剂组方特点，获取活性成分及作用靶点

统计分析肾苏合剂药物组成的性味、归经、功效，通过TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、BATMAN(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)平台，分别检索“黄芪”“细辛”“当归”“桃仁”“水蛭”，筛选口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18的活性成分，提取相关靶点。通过R studio软件对靶点进行筛选，添加靶点名称缩写，并与Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)信息规范化。

1.2 获取DN相关靶点

通过Gene Cards(https://www.genecards.org/)、CTD(https://ctdbase.org)、OMIM(https://www.omim.org/)数据库，分别输入关键词“diabetic nephropathy”，获取疾病相关靶点。Gene Cards数据库靶点数目较多，因此选取≥评分中位数的靶点为重要靶点。靶点评分最大值为59，最小值为2，中位数为44，故选择评分≥44的靶点为重要靶点。CTD数据库靶点数目较多，评分最大值为189.98，最小值为1.65，中位数为7.78。采用中位数筛选后，仍纳入较多低评分靶点，因此选择平均数作为筛选指标。靶点评分平均数为95.815，故选取评分≥95.815的靶点为重要靶点。OMIM数据库获得的靶点数目适中，因此全部纳入。

1.3 获取肾苏合剂-DN交集靶点

将肾苏合剂以及DN的相关靶点输入Venny 2.1平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，绘制韦恩图，并获取药物-疾病交集靶点。

1.4 构建“药物、成分、疾病、靶点”网络

将肾苏合剂-DN交集靶点导入Cytoscape软件，绘制“药物、成分、疾病、靶点”网络图。其中“节点”表示肾苏合剂活性成分以及药物-疾病交集靶点，“边”表示节点之间的相互作用关系。

1.5 构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络

将药物-疾病交集靶点导入STRING数据库(https://cn.string-db.org/)，设置物种“Homo sapiens”、“中等可信度0.4”，删除游离的节点。将数据分析结果保存为tsv格式，导入Cytoscape软件，构建PPI网络图。应用R软件筛选degree值前二十的靶点，为肾苏合剂治疗DN的核心靶点。

1.6 基因本体(Gene Ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析

应用R stuido软件进行GO、KEGG富集分析，将分析结果以气泡图和条形图的形式可视化。

1.7 活性成分-靶点分子对接

选择排名前5的肾苏合剂活性成分与排名前4的核心靶点进行分子对接。在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库导出核心成分的2D SDF结构，利用Openbable软件转化为PDB格式。从RCSB PDB(https://www.rcsb.org/)数据库中获得核心靶点的蛋白晶体结构，利用PyMOL软件清除原配体，并保存为PDB格式。运用AutoDock Tools软件对核心成分进行加氢、选为配体、选择扭转键等处理，对核心靶点采用去水、加氢、选为受体等处理，两者均保存为PDBQT格式。选择Grid > Grid Box，使用合适范围的盒子全部包裹蛋白，在Autodock软件进行分子对接模拟并得到对接结果。最后，选取结合能力排名前5的组合，使用PyMOL软件绘制3D结合模式图。

1.8 统计学方法

采用Excel 2019软件对肾苏合剂复方成分的药性、归经、功效的频次进行统计分析，并对药物和疾病的相关靶点进行去重和筛选。若靶点数目较多，则选取评分≥中位数或平均数的靶点纳入，以获取关联性更强的靶点；若靶点数目较少，则全部纳入。采用R软件筛选degree值前20的靶点为肾苏合剂治疗DN的核心靶点。

2 结果 2.1 肾苏合剂组方分析及活性成分筛选

肾苏合剂药物组成多为补益药、活血化瘀药，方药性味、归经、功效见表 1，以性温，味辛、甘，入心经、肝经为主，图 1为性味、归经分析，图中所标数值为用药频次统计。通过TCMSP、BATMAN平台共获得肾苏合剂活性成分66个，其中黄芪20个，细辛8个，桃仁23个，水蛭13个，当归2个，部分有效成分见表 2。

2.2 肾苏合剂及DN靶点筛选

通过R studio软件筛选后，共获得肾苏合剂靶点504个。Gene Cards、CTD、OMIM数据库共获得DN靶点2 646个，利用Venny 2.1平台绘制韦恩图并获取交集靶点243个，约占总数的8.4%，结果见图 2。

2.3 构建“药物、成分、疾病、靶点”网络

将肾苏合剂、243个交集靶点导入Cytoscape软件，绘制“药物、成分、疾病、靶点”网络图，见图 3。图中“红色节点”代表DN，“绿色节点”代表肾苏合剂，“黄色节点”代表药物-疾病交集靶点，“蓝色节点”代表药物活性成分，“边”代表各节点之间的相互作用，粗细代表作用强度，线条越粗表示其相互作用越强。

2.4 肾苏合剂治疗DN的PPI网络

将药物-疾病交集靶点导入STRING数据库，结果见图 4。图中共241个节点，2 331条边(2个游离节点被删去)。将数据库分析结果导入Cytoscape软件构建PPI网络图，结果见图 5。图中“节点”表示肾苏合剂治疗DN可能的关键靶点，节点的颜色和大小表示其在该网络中的重要性，节点越大，颜色越红，表示该靶点在治疗中发挥着越重要的作用；“边”表示靶点之间的相互作用关系，线条越粗代表相互作用越强。用R studio软件选取degree值前20位的靶点为肾苏合剂治疗DN的关键靶点，结果见表 3，包括：清蛋白基因(ALB)、AKT丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT1)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)、胰岛素基因(INS)等。

2.5 GO富集分析与KEGG富集分析

应用R软件富集分析安装包进行GO和KEGG富集分析。GO富集分析结果见图 6，共获取216条通路，主要涉及：DNA-转录因子结合(DNA-binding transcription factor binding)、RNA聚合酶Ⅱ-特异性DNA-转录因子结合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding)、受体配体活性(receptor ligand activity)等；KEGG富集分析结果见图 7，共获取192条通路，主要涉及：脂质和动脉粥样硬化(Lipid and atherosclerosis)、人巨细胞病毒感染(Human cytomegalovirus infection)、流体剪切应力与动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)等。

2.6 分子对接结果

根据肾苏合剂活性成分和关键靶点筛选，选择槲皮素、山柰酚、芒柄花黄素、异鼠李素、7-O-甲基异微凸剑叶莎醇和ALB、AKT1、IL-6、TNF进行分子对接，AKT1、ALB含有共晶配体，靶点蛋白信息见表 4，对接结合能见图 8中所标数值。通常来说，对接结合能≤-5.0 kcal/mol时，受体与配体的结合效果更佳，结合力较好的前5个对接结果见图 9。

3 讨论

近年来，随着生活方式的改变，DN的发病率逐年升高，为患者及其家庭带来沉重的经济负担。全国名老中医药专家、天津市名中医曹式丽教授，在长期临床实践中，将“瘀毒”作为DN毒损的核心，针对DN不同阶段，采取“辛通畅络”的用药特色，疗效显著^[10]。肾苏合剂作为辛通畅络法的代表方剂，由黄芪、细辛、桃仁、水蛭、当归组成。方中黄芪味甘，性温，入气分，长于补气养血，功擅行滞通痹；当归味辛、甘，性温，入血分，补血活血，为“血中气药”，两药相伍，气血相合，补益而不壅滞，行血而不动血，为辛甘通络之代表；细辛辛香温散，入肾经，散肾络沉寒，温通血脉；桃仁乃辛香草木之品，辛香走窜，除络中瘀毒；地龙辛、咸，搜风剔邪，引药入络。诸药合用，温、清、消、补诸法并施，共筑调补肾络之功^[5]。

肾苏合剂组方的性味、归经分析结果显示，心经、肝经、脾经比例最高，用药多以辛、甘、温为主。DN属糖尿病微血管并发症，高血糖可使血流动力学异常，导致血液高凝状态，血流速度减慢，有形成分沉积诱发血管炎症。吕仁和教授曾提出DN“微型癥瘕”病机理论，认为瘀血贯穿了DN全程，这与现代医学不谋而合^[11]。心主血，心生血，肝藏血，主疏泄，心、肝两脏共同推动并调控血液运行，维持脉道的充盈与通利。肝、肾精血同源，脾、肾相互资生，通过养肝血、健脾气实则调补肾脏。心气充盈、肝气调畅则血行有力，脾胃健运则生化有源，瘀毒化而新血生，肾络自和。久病多虚，久病多瘀，基于DN病机本虚标实这一特殊性，药物性味的选择以补中有动、散中有收、邪正兼顾为原则，强调以通为补。辛药能散能行，调和肾络气血，祛肾络瘀浊；甘药益气养血，补肾络虚损，与辛药相伍，行中有补，补中有动；温药温散寒凝，温而不燥，与辛药合用开肾络郁闭，温化肾气^[5]。

本文基于网络药理学和分子对接技术，共获取肾苏合剂活性成分66个，包括：槲皮素、山柰酚、芒柄花黄素、异鼠李素、7-O-甲基异微凸剑叶莎醇、常春藤皂苷元等。共获取DN -肾苏合剂交集靶点243个，包括：ALB、AKT1、IL-6、TNF、INS、IL-1β等。GO富集分析共获取216条通路，主要涉及：DNA-转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ-特异性DNA-转录因子结合、受体配体活性等。KEGG富集分析共获取192条通路，主要涉及：脂质和动脉粥样硬化、人巨细胞病毒感染、流体剪切应力与动脉粥样硬化等。

槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗病毒、免疫调节、抗血栓等多种药理作用。DN患者易合并感染，感染是诱发DN病情加重的重要因素，槲皮素可发挥其抗感染作用防止疾病复发及进展。DN高血糖状态导致血管内皮受损，加之大量蛋白尿，容易诱发高凝状态，槲皮素可预防血栓栓塞等不良事件发生，改善疾病预后。此外，槲皮素抑制肾小球细胞有丝分裂和凋亡，保护肾小球结构和功能，通过调控P2X7R/NLRP3、TGF-β/Smad通路抑制DN肾脏炎症反应及纤维化，改善肾脏胞外基质堆积^[13-15]。山柰酚具有抗氧化、抗炎活性。实验表明，山柰酚能够减少高糖诱导下ROS、NO、IL-1β的生成，抑制NLRP3炎症小体的激活，调控MAPK/AKT通路，减轻氧化应激及肾小球内皮细胞凋亡。此外，山柰酚可抑制肾小管细胞Rho A/Rho激酶活化介导的炎症反应，减少促炎因子表达，保护小管功能^[16-18]。山柰酚还可以抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞异常增殖，保护肾脏^[19]。异鼠李素具有较好的清除氧自由基作用，可以抑制氧化应激及NF-κB的过度激活，减少下游炎症因子生成。异鼠李素可扩张冠脉，增加冠脉血流量，改善心肌缺氧、缺血，降低血清胆固醇，抑制血小板聚集，预防DN心血管并发症的发生。肾脏病理方面，异鼠李素可有效减轻DN大鼠肾小球肥大、基底膜增厚、系膜基质扩张及肾小管上皮细胞损伤。总体而言，肾苏合剂上述活性成分可能从抑制炎症反应、抑制氧化应激、减少细胞凋亡等方面减轻DN肾损伤，改善DN预后。

DN-肾苏合剂243个交集靶点中，AKT1、IL-6、TNF等发挥着更重要的作用。AKT1是蛋白质编码基因，是PI3K通路的关键节点。既往研究表明，PI3K/AKT信号通路在细胞增殖和胶原蛋白生成中起关键作用，并参与DN上皮-间质细胞转分化^[20]。自噬在DN发病机制中起核心作用，研究发现，PI3K/Akt通过上调mTOR活性导致自噬受损是DN发病的关键^[21]。IL-6编码一种参与炎症反应和B细胞成熟过程的细胞因子，随机对照研究表明，IL-6的表达增加和DN进展有关^[22]。TNF编码一种促炎细胞因子，参与细胞增殖、分化、凋亡等多种生物过程。TNF-α一方面诱发胰岛素抵抗，导致糖尿病恶化，使DN病情加重，另一方面，通过促进炎症因子的合成和分泌，刺激肾小球系膜细胞分泌氧自由基，损伤肾小球^[23]。

分子对接显示，结合力较好的前5个对接结果为：芒柄花黄素-TNF，槲皮素-AKT1，7-O-甲基异微凸剑叶莎醇-TNF，槲皮素-TNF，7-O-甲基异微凸剑叶莎醇-IL-6。其中，槲皮素-AKT1、槲皮素-TNF在DN领域已有许多研究报道，如罗鑫鑫^[24]、陈阳^[25]等人的研究。TNF是常见的促炎细胞因子，AKT1参与调控细胞凋亡和葡萄糖代谢，该结果提示，肾苏合剂通过干预炎症反应及代谢进程防治DN。不足的是，现有文献研究关于槲皮素与TNF、AKT1的对接分析多局限于机制层面，并且研究的复方不尽相同，药物种类繁多，而槲皮素广泛存在于很多中药的活性成分中，因此难以提炼出有效的单药或药对应用于临床。可喜的是，Dong等^[26]用黄芪-当归化合物干预DN的研究发现，IL-6、TNF与槲皮素、山柰酚等成分具有一定的结合活性，这与本研究分子对接的结果不谋而合，黄芪-当归作为肾苏合剂组方成分当中“辛甘通络”的代表，提示其可作为关键配伍应用于DN治疗，同时也为“辛甘通络”法的临床使用提供了理论基础。此外，本研究还丰富了对肾苏合剂的组方认识，有望拓展肾苏合剂的临床应用。芒柄花黄素、7-O-甲基异微凸剑叶莎醇存在于中药黄芪中，既往研究表明，黄芪中的黄酮类化合物促进胰岛素分泌，降低血糖水平，本研究中黄芪有效成分与TNF、IL-6的结合提示，黄芪在方中的作用不仅降低血糖，更多的是发挥了其清除氧自由基、调节免疫、抗炎、抗凋亡的功效，从而延缓DN进展。研究还表明，上述对接结果与心脑血管疾病关系密切，表现为保护心肌、改善心肌缺血、保护脑神经、保护血脑屏障。因此，本研究结果提示：肾苏合剂可能具有潜在的防治DN相关心脑血管并发症的作用。

富集分析显示，DNA-转录因子结合、脂质和动脉粥样硬化、流体剪切应力与动脉粥样硬化等通路为肾苏合剂治疗DN的重要信号通路。炎症反应是动脉粥样硬化的核心环节，DN患者糖脂代谢异常，连同机体微炎症状态，导致血管内皮损伤，容易诱发冠脉粥样硬化等心脑血管不良事件的发生。从中医理论分析，DN动脉粥样硬化可视作中医的“浊瘀阻塞”，而“辛通畅络法”正是以能散能行之辛药为主，或辛香通络，或辛咸通络，或辛甘通络，或辛润通络，祛除络脉浊邪、瘀毒，从中医角度证实了肾苏合剂富集分析结果的合理性；从现代医学分析，辛通畅络法可调控炎症反应，其代表方剂肾络宁、肾苏Ⅱ，可有效减少TNF-α、IL-1、IL-13和IL-6的表达，延缓疾病进展。本研究结果显示，肾苏合剂通过IL-6、TNF、IL-1β等关键靶点，调控脂质和动脉粥样硬化、流体剪切应力与动脉粥样硬化等信号通路，再次证明了“辛通畅络法”干预炎症因子表达，从而防治DN及其心脑血管并发症的可能性及合理性。

综上所述，肾苏合剂可能通过ALB、AKT1、IL-6、TNF、INS、IL-1β等多个关键靶点，调控DNA-转录因子结合、受体配体活性、脂质和动脉粥样硬化、流体剪切应力与动脉粥样硬化等多个信号通路防治DN，本研究的分子对接和富集分析结果挖掘了肾苏合剂防治DN心脑血管并发症的潜在优势，为“辛通畅络法”提供了理论基础，也为肾苏合剂的临床实践提供了新的思路，确切机制仍需后续进一步实验加以验证。