失血性休克（HS）是常见的急危重症，通常是因各种原因致机体大量失血引起全身有效血容量减少，组织灌注不足，急性微循环障碍，从而导致组织、细胞代谢紊乱和功能障碍的综合征^[1]。据报道，全球范围内每年因失血性休克而死亡的创伤患者就超过160万人，给人类的财产和生命健康造成了极大的损害^[2]。中国海拔3 000 m以上的地区约占全国总面积的1/6，驻高原部队官兵最高执勤点位于海拔5 200 m左右，空气氧含量只有海平面的50%，面临高原缺氧和低温的双重考验^[3]。研究发现，当在高温、低温、高原等极端环境下发生HS时，机体血流动力学、氧动力学及中心体温的变化与平时不同，可加剧机体代谢和耗能，且随着时间延长，组织缺氧恶化，造成多器官损伤^[4]。因此，积极探讨低温低氧条件下本病的治疗方法，具有十分重要的意义。本研究基于正交设计，探讨不同浓度的复方蕨麻胶囊在不同海拔高度的复苏效果。

1 材料与方法 1.1 实验动物

选择SPF级健康SD雄性大鼠27只，鼠龄8~10周，大鼠体质量350~400 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证编号NO.SCXK（京）2019-0010，饲养于12 h光照/12 h黑暗交替的标准环境中，维持环境温度22~25 ℃，湿度50%~60%，自由进食进水。大鼠运回中国人民武装警察部队特色医学中心实验室适应1周，自由饮水。实验动物伦理审批号：动物2024-0017。

1.2 药物、试剂和仪器

复方蕨麻胶囊（由蕨麻、红景天、枸杞、葛根组成）由中国人民武装警察部队特色医学中心提供；吸入用七氟烷（上海恒瑞医药有限公司，国药准字：H20213735，规格：120 mL），羟乙基淀粉（200/0.5）氯化钠注射液（华润双鹤药业股份有限公司，国药准字：H20050886，规格：500 mL），肝素钙注射液（成都市海通药业有限公司，国药准字：H51021395，规格：1 mL：10000单位）；小动物人工呼吸机（众实科技，型号：ZS-MV-HXB），麻醉机（MIDMARK，型号：Matrx VIP3000），监护仪（Infinity Delta，型号：Infinity^® Delta），微循环检测仪（徐州利华电子科技发展有限公司，型号：LH-SDF-2）。

1.3 正交设计

依据实验设计目的，采用三因素三水平的正交设计，选取L₉（3⁴）正交表，设置三个因素：A为氧含量（海拔）、B为温度、C为药物浓度，每个因素设计3个水平，得出9个组合方案，具体因素水平及试验安排见表 1、表 2。

1.4 造模^[6]

大鼠根据分组提前七天^[7-8]灌胃复方蕨麻胶囊低（27 mg/kg）、中（54 mg/kg）、高（81 mg/kg）剂量，禁食水12 h后腹腔麻醉大鼠并开启保温毯，气管插管以维持麻醉及吸氧、股动脉置管以监测血压、颈静脉置管以放血输血进行液体复苏、粘贴电极片以监测心率、探头放入肛门以监测肛温、腹部正中切开2 cm以观察肠系膜微循环。含肝素的注射器从颈静脉置管中抽血，直到血压稳定在35~45 mmHg（1 mmHg≈0.133 kPa）并能持续1 h停止抽血（将抽出的血液放入4 ℃冰箱保存，并于复苏开始前10 min取出复温）；关掉保温毯，连接氧气瓶（氧气含量13.5%、14.5%、15.2%），加上自制泡沫箱达到局部低温（温度5~10 ℃、10~15 ℃、15~20 ℃），观察1 h后去掉低温低氧；开启保温毯，并将抽出的所有血液连同肝素一起从颈静脉置管回输，复苏后血压在80~90 mmHg视为复苏成功。复苏后继续观察5 h后处死。所有有创操作均在无菌条件下进行。见图 1。

1.5 监测指标 1.5.1 生命体征

1）MAP：通过股动脉连接的监测仪记录放血前（T）、复苏前（T0）、复苏后1h（T1）、复苏后2 h（T2）、复苏后3 h（T3）、复苏后4 h（T4）、复苏后5 h（T5）七个时间点的MAP。2）HR：通过电极片连接的监护仪测量七个时间点的心率并记录；

1.5.2 肠道微循环监测

使用侧流暗场成像（SDF）技术实时采集7个时间点的肠道微循环视频（检测方式：将SDF探头置于肠系膜上方，调整视野焦距获得清晰稳定血流图像，见图 2），使用BI-2000医学图像分析系统对录制的视频进行分析，得出肠系膜血管流速、所有灌注血管总长度在采集窗口面积的密度（PVD）、MFI。其中MFI被用来描述微循环灌注的流速，将显示屏分为四个象限，根据每个象限中总体血流情况给予评分血流评分：未灌注：评分0；间流：评分1；缓流：评分2；正常：评分3；高速：评分4。

1.6 统计学方法

全部数据运用Excel表格录入，SPSS 21.0软件分析。七个时间点的MAP、HR和肠系膜流速采用重复测量方差分析，如果满足球对称假设（P≥0.1）则用球形度取值，如果不满足球对称假设则用格林豪斯-盖斯勒法（Greenhouse-Geisser，G-G法）取值；两两比较时如果方差齐用LSD检验，方差不齐用Tamhane’s检验。计算出最佳时间点后进行正交设计的统计。

正交实验对肠系膜指标（包括血管流速、PVD、MFI，均使用差值，计算方式为T1-T0）进行直观分析，计算出k和r值，k值的大小代表了该水平对最终结果影响的大小，k值越大，表示该水平对结果的影响越大；r值大小代表了该因素对最终结果影响的大小，r值越大，表示该因素对结果的影响越大。方差分析中，F值越大，表示该因素的总体治疗效果越好。检验标准为α=0.05（即P＜0.05表示差异具有统计学意义）。

2 结果 2.1 复苏后最佳时间点的筛选 2.1.1 7个时间点MAP变化的比较

MAP数据经过重复测量方差分析得出：1）组间*组内分析，得到F=1.471、P=0.051，认为各组大鼠的MAP在不同时间点变化趋势一致。2）主体间效应分析，得到F=1.002、P=0.467，九组对MAP的影响差异无统计学意义。3）主体内效应分析，得到F=417.804、P＜0.001，认为九组MAP在不同时间点不全相等，大小关系为：T＞T1＞T2＞T3＞T4＞T5＞T0，各时间点的两两比较均P＜0.001。见表 3、图 3。

2.1.2 7个时间点HR变化的比较

1）各组大鼠的HR在不同时间点变化趋势一致（F=0.782，P=0.730）。2）组间差异无统计学意义（F=0.647，P=0.729）。3）各组HR在不同时间点不全相等（F=947.477，P＜0.001），大小关系为：T＞T1＞T2＞T3＞T4＞T5＞T0，各时间点的两两比较均P＜0.001。见表 3、图 4。

2.1.3 7个时间点血管流速的比较

1）各组大鼠的肠系膜血管流速在不同时间点变化趋势不同（F=4.933，P＜0.001），第一组与第二组差异有统计学意义（P=0.032），第二组与第五组差异有统计学意义（P=0.270），第二组与第八组差异有统计学意义（P=0.008），第二组与第九组差异有统计学意义（P=0.009），第四组与第八组差异有统计学意义（P=0.024），第四组与第九组差异有统计学意义（P=0.026）。2）组间流速差异无统计学意义（F=2.141，P=0.086）。3）各组T在不同时间点不全相等（F=82.425，P＜0.001），大小关系为：T＞T2=T1＞T3＞T5=T4＞T0，T1与T2差异没有统计学意义（P=0.845），T4和T5差异没有统计学意义（P=0.760）其余时间点两两比较均P＜0.001。见表 5、图 5。

2.1.4 小结

根据以上3组数据的时间点排序进行综合分析，在复苏后的五个时间点里，T1的MAP、HR和肠系膜流速最接近T，说明这个时间点的指标改善最佳。因此，后续分析均选用T1的数据分析。

2.2 本实验条件下的最佳组合 2.2.1 改善血管流速的最佳组合

对血管流速差值进行直观和方差分析。由表 6、7可知：1）直观分析比较R值大小得出各因素影响程度：R_A＞R_B＞R_C；比较k值大小得出：k_A1、k_B2、k_B2即最佳水平为A₁B₂C₂。2）方差分析得出水平A（F=8.035，P=0.002）、B（F=2.457，P=0.109）、C（F=0.188，P=0.830）。3）结果表明改善血管流速的最佳组合为第二组（A₁B₂C₂），氧含量对血管流速影响最大。

2.2.2 改善PVD的最佳组合

对PVD的差值进行直观和方差分析。由OSID表中可知：①直观分析比较R值大小得出各因素影响程度：RA＞RC＞RB；比较k值大小得出：kA1、kB2、kC2即最佳水平为A1B2C2；②方差分析得出水平A（F=0.366，P=0.732）、B（F=0.179，P=0.848）、C（F=0.319，P=0.758）；③结果表明改善PVD的最佳组合为第二组。

2.2.3 改善MFI的最佳组合

对MFI的差值进行直观和方差分析。由OSID表中可知：①直观分析比较R值大小得出各因素影响程度：R_A＞R_C＞R_B；比较k值大小得出：k_A1、k_B2、k_C2即最佳水平为A₁B₂C₂。2）方差分析得出水平A（F=0.048，P=0.955）、B（F=0.141，P=0.876）、C（F=0.048，P=0.954）。3）结果表明改善MFI的最佳组合为第二组。

2.2.4 小结

根据各指标直观和方差得出，氧含量选择13.5 ℃、温度选择10~15 ℃、药物浓度选择复方蕨麻胶囊中剂量（即第二组）对各指标改善效果最好且数据有统计学意义。

3 讨论

当人从平原急进高原时，如果机体应激水平超过正常范围或机体无法及时调整机能，会发生呼吸、消化、神经和血液循环系统等应激反应^[9]。中医药是历经我国各族人民上千年检验和积累而成的巨大宝库，在防治高原缺氧方面药用历史悠久、品种丰富、功效确切且毒副作用小^[10]。因此，本课题尝试从治疗高原病角度切入，寻找对高原HS的有效的中药。

高原特殊环境对疾病的影响在中医里并没有明确论述，根据症状不同而归为不同疾病。从病因病机角度来说，认为主要由环境清气缺乏、宗气不足^[11]，使一身之气不足，导致肺部和其他脏腑虚损，造成机体气虚；再加上温度低，寒凝气滞，气滞则血瘀，因此，治疗多从温阳补气活血入手。HS在中医属于血脱、血厥，再加上高原的特殊地理环境，气滞血瘀更严重，与西医认为的低温低氧环境会加重HS一致^[12]。

复方蕨麻胶囊以蕨麻为君药，红景天、葛根、枸杞子为臣药，具有健脾益肾、生津止渴、益气补血等功效。刘冬妍^[13]的研究对小鼠进行窒息性、急性减压及断头缺氧实验及慢性缺氧实验，结果发现复方蕨麻胶囊可能通过提高机体抗氧化应激能力以发挥对高原缺氧的保护作用，还发现该药物对高原缺氧导致的心肌损伤有保护作用。《素问·阴阳应象大论》强调“治不法之纪，不用地之理，则灾害至矣”，因此组方时用了三味生长在高原的药物，以本地之药解本地之“毒”，契合万物相生相克。蕨麻又名人参果，被《青海高原药物图鉴》^[14]认为是“常用上药”，可以抗缺氧、保护心肌细胞。王旭萍^[15]的研究发现蕨麻能够降低促炎因子含量、升高抗炎因子含量，进而起到治疗急性高原缺氧的作用。王仁杰等^[16]人在数据挖掘高原性缺氧的组方规律时发现，红景天、枸杞子使用频次较高，补气活血药占比最高。红景天被誉为“高原人参”，具有适应原样作用和双向调控作用，可以促使机体对不同刺激引起的异常反应向常态转移。周争光等^[17]的研究表明，红景天苷能够降低缺氧对内皮细胞的损坏。王子晗^[18]研究发现，红景天苷能够改善急进高原大鼠的缺氧状态，纠正酸中毒，抑制炎症反应和氧化应激。枸杞生长喜冷凉气候且耐寒，有平补阴阳之功，严文英等^[19]研究发现枸杞多糖能够通过改善线粒体功能及抑制细胞自噬蛋白的表达而减少细胞凋亡、减轻缺糖缺氧HK-2细胞的损伤。葛根部分生于海拔1000-3200米的山沟林中，具有升阳的作用，《素问·五常政大论》中论述：“天不足西北，左寒而右凉……气有温凉，高者气寒……西北之气，散而寒之。”因此对于高原低温环境，应该升阳散寒。方中葛根、枸杞子为国家卫生部规定药食同源品，蕨麻、红景天国家卫生部规定可用于保健食品^[20]，表明由该处方制备的制剂无毒副作用，适合长期使用。

HS病理以微循环障碍为主，涉及凝血功能障碍、炎症介质变化、供氧量减少、心脑肺耗氧器官快速衰竭等等，本研究选取七个时间点，观测指标以微循环为主，还包括对血压、心率生命体征的监测。

生命体征指标虽然各组间没有统计学意义，但从各个趋势图来看，以血压变化最为明显。放血期间，少量抽血到达休克标准的血压后，大鼠会维持40 min左右后血压再上升到放血前的水平，此时再抽一定量的血才能达到休克标准（35~45 mmHg维持1 h），这个现象和临床HS患者生理现象一致，即一般15 min内的失血量少于全身血量的10%，机体通过代偿可使MAP及组织灌流量维持稳定，但若快速失血占全血量的15%~25%，尽管机体充分发挥代偿仍不能维持MAP和组织灌流量，随即出现休克表现^[21]。达到休克后加上低温低氧条件，血压会再下降7 mmHg左右，在20 min左右会回升到刚放血成功的血压，维持1 h休克状态后回输全血后，最高血压多数比放血前低，偶尔比放血前高但不会超过10 mmHg的差距。复苏后血压持续下降直至死亡或实验终止，期间几乎不会回升，与Nugent^[22]的研究趋势相似。心率变化趋势和血压基本一致，但与血压不同的是复苏后某些时间点会回升，但原因还需要进一步研究，推测有可能是炎症引起的心率加快。

综上生命体征指标的描述，说明在低温低氧状态下的HS，大鼠血压和心率会在正常基础上降低一部分，佐证了高原条件下特殊环境会给治疗疾病带来困难。另外，这些指标整体呈一路下降的趋势，并不能说明治疗无效，而是由于疾病本身就危急且复杂，再加上仅监测了部分指标，并不能像临床一样实行个体化的方案对其进行后续治疗，也是本研究的局限性之一。

对于肠系膜微循环指标的变化来说，也有一定规律。1）放血前流速很快，每根血管几乎没有断流，只是流速快慢的区别。MFI是微循环血流指数指标评分，根据专家共识^[23]解读，评分大于2.9分属于正常状态，而小于2.6分属于微循环异常，如果从2.6向2.9发展，预后好，反之预后差。放血前MFI评分均高于3。2）复苏前由于失血出现缓流、断流甚至不流的状况，有些血管直接消失但整体血管分布大致不变，PVD下降，虽然血管长度不变，但灌注血管的长度变短，MFI评分均小于2.6，说明机体出现微循环障碍，可能与失血后循环血量减少和血管收缩有关，与HS引发的微循环缺血和血管张力降低的病理表现相符^[24]。3）复苏后1h多数血管流速恢复但比放血前稍低，这时候血管长度和直径变化并不一致且各组不一，是因为出现了微小血管的融合、大血管直径变粗，说明在复苏后全身血液重新分布，会优先供给较大的血管而损失一些更微小的血管，以保证全身血液分布，因此得到融合的血管直径会变粗而长度变长或不变，被损失的小血管直径变窄、长度变短或不变。PVD更加严谨一点，计算的是灌注血管长度占总视野的密度，因此复苏后1 h应该比复苏前高，越接近放血前说明效果越好，微循环恢复得越好，第二组的MFI评分复苏后5h内均在2.9分及以上，而其他组在复苏后1 h在2.9分，其它时间点虽然是升高趋势但评分还未恢复；

通过正交设计选出的第二组，血压下降程度缓，HR保持稳定，肠系膜流速始终保持较快且下降幅度低，血管损失较少，具体见图 6。MFI评分从复苏后到实验结束都保持在2.9分以上，PVD保持在组间较高状态，说明与其它组别相比，第二组复苏效果最佳。其它组别指标改善不如第二组明显，推测可能是个体差异或者人与大鼠的机体条件不一致所致，也可能是有其他原因，需要后续实验验证。本研究筛选出的第二组也只是在本实验条件下的最优选择，至于进一步测量更多HS的相关指标效果如何，或者推广后的临床效果，都需要更多的研究论证。

综上所述，通过对MAP、HR和肠系膜流速各时间点的比较，得出复苏后1h这个时间点是实验最佳观测点；分析复苏后1 h的微循环指标得出第二组在本研究条件下效果最佳，表明中剂量复方蕨麻胶囊更适用于3 500 m左右的HS。