糖尿病（DM）是一种常见的持续性代谢疾病，其主要原因是胰岛素分泌不足和/或胰岛素抵抗（IR）等因素导致机体血液中葡萄糖水平升高^[1]。其中2型糖尿病（T2DM）占所有DM病例的95%以上，并且呈现逐年增加的趋势^[2]。目前，DM患者需要长期服药，但长时间口服降糖药物容易导致耐药性和不良反应^[3]。相比之下，天然药食同源的中药材副作用极小，并且具有温和持久的药效，对降低血糖、提高胰岛素敏感性和抗氧化等方面具有综合调节作用^[4]。西医在防治T2DM及其并发症方面对中药复方的研究取得了良好的成效。

萸精降糖方是由陕西省中医医院内分泌科沈璐主任医师根据长安米氏内科流派的学术思想指导下，结合传统中医药理论和长期临床实践研制而成。该方包括山茱萸、黄精、西洋参、枸杞子、知母和绿茶。在先前的临床研究中，笔者发现连续服用萸精降糖方1个月对糖耐量异常和T2DM患者的血糖有降低作用，并取得了较为理想的治疗效果^[5]。在动物实验中，也证实了萸精降糖方对T2DM模型大鼠具有降血糖、调节脂质代谢、改善IR和抗氧化应激的作用^[6]。然而，萸精降糖方的具体降糖机制尚未得到深入研究，因此需要通过新方法来探索和阐明其作用机制，以全面了解该方对T2DM的治疗作用。研究利用网络药理学和分子对接技术预测萸精降糖方治疗T2DM的有效成分、潜在靶点和作用途径，旨在为该方防治T2DM提供更多的理论依据。

1 资料与方法 1.1 筛选萸精降糖方的有效成分和靶点

研究在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索萸精降糖方中的山茱萸、黄精、西洋参、枸杞子和知母成分，并以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18作为筛选条件，从而获得有效成分和相关靶点^[7]。使用中药分子机制生物信息学分析工具（BATMAN-TCM）对绿茶进行检索，并以Cut off > 20为筛选条件，获得有效成分及相关靶点。通过UNIPORT数据库对gene symbol进行了规范标准化处理^[8]。

1.2 筛选T2DM的靶点

使用人类基因数据库（GeneCards）、疾病相关的基因与突变位点数据库（DisGeNET）、人类孟德尔遗传数据库（OMIM）检索关键词“diabetes mellitus type 2（noninsulin-dependent diabetes mellitus）”，GeneCards数据库获取筛选相关性（Relevance score）≥10的靶点，DisGeNET数据库获取筛选相关性≥0.1的靶点，OMIM数据库未进行筛选。整合上述3个数据库的数据并删除重复数据后，得到与T2DM相关的靶标。

1.3 构建靶点蛋白互作（PPI）网络

利用VEENY2.1对药物靶点和疾病靶点进行处理和整合，获得交集靶点。使用STRING数据库获取PPI网络，将“minimum required interaction score”设置为0.9，并设置删除孤立点，保存数据并将结果导入Cytoscape 3.7.2进行可视化分析。

1.4 基因本体（GO）富集和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

使用R软件及其后台数据库“org. Hs. eg. db”获取潜在作用靶点的基因ID，再利用“DOSE”“cluster Profiler”“path view”程序包设定pvalue Cutoff及qvalue Cutoff为0.05，进行GO和KEGG分析。按照显著性对每一类进行排序，并从GO富集分析的生物学过程（BP）、细胞组成（CC）和分子功能（MF）3个方面选择前10条富集条目，绘制成柱状图进行分析。以P-Value值从高到低排列，并通过气泡图的形式展示和分析前20条通路。

1.5 构建“药物-有效成分-靶点-通路”网络图

根据药物与疾病的交集基因，从药物数据中选取相应数据，并选择KEGG通路中的前20个信号通路。将这些数据导入到Cytoscape 3.7.2中以构建“药物-有效成分-靶点-通路”网络图。

1.6 “有效成分-靶点”分子对接

利用PubChem数据库获取配体的3 D。通过SYBYL-X 2.0对配体进行分子优化，参数设置如下：采用Tripos力场，选择Gasteiger-Hückel电荷。最大迭代系数设置为10 000，能量梯度限制在0.005 kcal/（mol·A），未说明参数均设为默认值。受体的3D结构从RCSB数据库获取，并采用mgltools-win32-1.5.6进行修复、去除水分子和金属离子等预处理。利用Auto Dock Vina 1.1.2进行分子对接，最后使用Discovery Studio进行数据的图像可视化。

2 结果与分析 2.1 萸精降糖方的有效成分和靶点

利用TCMSP数据库筛选出萸精降糖方部分中药有78个有效成分，其中包括山茱萸14个、黄精8个、枸杞子35个、西洋参9个和知母12个。利用BATMAN-TCM数据库筛选出绿茶有效成分有10个。因此，萸精降糖方共有88个有效成分。经过整理去重后，以上有效成分对应作用靶点共得到377个。表 1中列出了萸精降糖方中山茱萸、黄精、枸杞子、西洋参和知母的前3个OB值最高的有效成分和绿茶的前3个有效成分。

2.2 2型糖尿病的靶点

通过GeneCards数据库搜索数据，得到16 035个T2DM相关靶点，DisGeNET数据库得到3 134个，OMIM数据库得到290个。对3个数据库的数据进行整合和去重后，共获得7 275个靶标，例如HNF4A、PAX4、PPP1R3A、AKT2等。

2.3 靶点蛋白互作网络图

通过检索TCMSP和BATMAN-TCM数据库，收集有效成分靶点。利用VEENY2.1对药物靶点和疾病靶点进行处理和整合后，发现共有311个交集靶点，其中蓝色代表药物靶点，黄色代表T2DM靶点，重叠部分为交集靶点，如图 1所示。

将整理得到的311个交集靶点数据输入STRING数据库，将得到的PPI数据结果导入Cytoscape3.7.2进行可视化分析，结果显示有260个节点和1 890条边。PPI网络图颜色越深、图形越大，代表degree值越高，表明其对应的靶点在网络中的重要性越高^[9]。因此，列出了前10个交集靶点及相关信息，见表 2。如图 2所示，Degree排在前列的靶点有TP53、AKT1、TNF、SRC、ESR1和IL6等。结果表明，以上靶点与萸精降糖方对T2DM的作用密切相关。

2.4 GO富集和KEGG通路富集分析结果

GO功能富集分析条目共3 283条。包括3个方面：BP有2 922个条目，主要包括伤口愈合、对异生物刺激反应、对营养水平反应等方面；CC有124个条目，主要包括膜筏、膜微区、囊泡腔等方面；MF有237个条目，主要包括DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、丝氨酸水解酶活性等方面。如图 3所示，GO图中线条长度越长，表示富集的基因数目越多。结果表明，萸精降糖方的有效成分通过参与多种生命进程来治疗T2DM。

KEGG通路富集分析条目共92条。前20条信号通路在萸精降糖方治疗T2DM中起到重要作用，见图 4。KEGG图形气泡越大，表示富集基因的数目越多；气泡颜色越红，表示显著性越高。

2.5 “药物-有效成分-靶点-通路”网络图构建

根据萸精降糖方中药物与疾病的交集基因，将对应的数据从药物数据中选取并导入Cytoscape 3.7.2中构建“药物-有效成分-靶点-通路”网络图进行可视化分析，见图 5。图中不同颜色倒三角形、圆形分别代表药物和相应的有效成分；绿色菱形代表作用靶点；蓝色三角形代表信号通路。连线表示各节点之间的相互作用关系和强度。

2.6 “有效成分-靶点”分子对接

将“药物-有效成分-靶点-通路”网络图中Degree值最高的两种有效成分（槲皮素、山柰酚）分别与PPI网络图中Degree值最高的两个关键靶点（TP53、AKT1）进行分子对接验证。当配体与受体的结合能小于-5.0 kcal/mol时，表示其具有良好的结合活性；当结合能小于-7.0 kcal/mol时，则表示具有较强的结合活性^[10]。利用Auto Dock Vina 1.1.2进行分子对接，结果如表 3所示，两种有效成分槲皮素和山柰酚与核心靶点TP53、AKT1的结合能均小于-5.0 kcal/mol，表明有效成分与对应的核心靶点具有较好的结合活性。其中，槲皮素和山柰酚与AKT1的结合能均小于-7.0 kcal/mol，表明有较强的结合活性，可能是萸精降糖方对T2DM治疗起重要作用的关键成分。有效成分槲皮素和山柰酚与核心靶点TP53、AKT1的分子对接结果使用Discovery Studio进行可视化分析，如图 6所示。

3 讨论

近年来，中药复方在治疗T2DM方面的显著疗效引起了医学和科研人员的关注。现代研究也越来越多地探讨相关中药复方对T2DM的作用机制。王芳等^[11]研究发现，白虎加人参汤通过调节PI3K/Akt/FoxO1信号通路，可以有效降低T2DM大鼠的空腹血糖和糖化血红蛋白水平，保护胰腺组织。侯瑞英等^[12]研究发现，消渴舒方可通过改善T2DM模型大鼠血清炎症因子和抑制TLR4/NF-κB信号通路，发挥降血糖作用。

萸精降糖方中山茱萸、黄精、西洋参具有补气养阴，健脾益肾，清热生津等功效；枸杞子、知母具有滋补肝肾，滋阴润燥等功效；绿茶可发挥生津止渴的作用。以上药材标本兼治，具有益气养阴、健脾益肾、生津润燥的作用。为了进一步了解萸精降糖方的作用机制，研究采用了现代网络药理学和分子对接技术，对该方治疗T2DM进行了分析。

研究发现，萸精降糖方可通过88个有效成分和260个靶点治疗T2DM。PPI网络结果分析初步显示，TP53、AKT1、TNF等靶点在萸精降糖方治疗T2DM中起重要作用。这些核心靶点参与氧化应激反应、炎症反应和免疫调节。例如，TP53是一种关键的肿瘤抑制因子，在多种应激信号下被激活，参与包括氧化应激在内的多种细胞反应，还影响代谢途径^[13]。Sliwinska等^[14]研究发现，T2DM患者的TP53水平随着DM年龄和持续时间的增加而升高，其高血糖诱导的基因表达变化在DM代谢紊乱和血管并发症的发生中起核心作用。Homayounfar等^[15]研究表明，过多的热量摄入会导致T2DM小鼠脂肪组织的氧化应激积累，进而促进衰老模样的改变，包括TP53表达增加和促炎因子产生增加。激活AKT1可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，并参与葡萄糖代谢等细胞过程^[16]。Rui^[17]发现，增加胰岛细胞中AKT的表达可减少凋亡，增加胰岛细胞的分泌功能。TNF为重要的炎性因子，在T2DM的免疫炎症机制中起重要作用^[18]。炎症介质被认为是导致IR的重要因素，而IR则导致T2DM的发生。综上所述，萸精降糖方通过以上核心靶点在治疗T2DM中具有重要作用。

通过GO富集分析和KEGG通路富集分析发现，萸精降糖方可通过脂质与动脉粥样硬化通路、AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路等92条通路防治T2DM。

脂质代谢紊乱与动脉粥样硬化密切相关，导致动脉粥样硬化脂质包括总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平升高和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平降低。T2DM患者常伴有血脂异常，这是T2DM的病理学特征之一。DM和动脉粥样硬化的主要病理机制包括血脂异常、糖基化（AGE）产生的高血糖、氧化应激和炎症等^[19]。在前期动物实验中，DM模型组大鼠的血清TC、TG、LDL-C水平明显升高，而HDL-C水平降低，说明DM大鼠存在脂质代谢紊乱，发生糖尿病血管并发症的风险增加。经萸精降糖方干预后，大鼠的血脂指标明显改善，因此，推测萸精降糖方可能通过脂质代谢途径发挥作用，提示脂质与动脉粥样硬化信号通路是萸精降糖方防治T2DM的作用机制之一^[6]。长期的高血糖会导致体内许多蛋白质发生非酶糖基化，形成晚期糖基化终末产物（AGEs），这些AGEs长期积累，导致糖化应激，并在AGEs受体（RAGE）与AGEs结合后诱发氧化应激和炎症等反应^[20]。AGE/RAGE信号通路与DM及其并发症密切相关。于嘉祥等^[21]通过动物实验发现，中药复方益糖康（黄芪、黄精、五味子、枸杞子等）可能通过抑制AGE/RAGE信号通路中的AGEs和RAGE等蛋白，发挥抗炎、抗氧化应激和细胞凋亡作用。越来越多的数据表明，T2DM的发病机制与炎症反应有关^[22]。TNF信号通路作为重要的炎症反应通路，可以激活NF-κB、MAPK等诱导炎症细胞浸润并参与氧化应激反应，还能通过影响PI3K/Akt信号通路传导影响机体糖代谢^[23]。吴巧敏等^[24]通过山柰酚治疗T2DM模型大鼠发现，山柰酚可降低高剂量组大鼠炎症因子IL-6和TNF-α水平，改善ISI，从而对T2DM大鼠的慢性并发症起到保护作用。

通过构建“药物-有效成分-靶点-通路”网络模式，证明萸精降糖方中的槲皮素和山柰酚等有效成分在治疗T2DM方面具有巨大潜力。槲皮素是1种类黄酮化合物，具有多种生物活性，例如抗氧化、抗炎、降血糖和增强胰岛素敏感性^[25]。Henagan等^[26]研究发现槲皮素对DM模型大鼠和小鼠具有降血糖、改善胰岛功能和提高胰岛素敏感性的作用。研究表明，槲皮素能降低肝组织中葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）的含量，提高己糖激酶的活性，防止肝组织氧化损伤，从而保护肝组织^[27]。山柰酚是1种天然类黄酮化合物，具有降血糖、抗炎、抗氧化和降血脂等作用^[28]。在DM中，山柰酚能防止胰腺β细胞氧化损伤，其原因可能与山柰酚能恢复非酶抗氧化剂和酶抗氧化剂水平相关，从而降低β细胞中的葡萄糖^[29]。此外，山柰酚还能通过提高葡萄糖激酶水平和促进糖原合成来降低血糖水平，当胰岛素信号被激活时，AKT磷酸化并抑制FOXO1的转录，最终抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）和G6Pase的表达^[30]。萸精降糖方能降低T2DM模型大鼠肝组织中PEPCK和G6Pase含量。其降糖机制可能是通过降低其蛋白表达能力来抑制肝糖异生，从而促进肝糖原的合成，以达到降低血糖的目的^[31]。

通过对有效成分槲皮素和山柰酚与其对应的核心靶点TP53和AKT1进行分子对接验证，发现均成功对接，并且存在结合位点。此外，结合能均小于-5.0 kcal/mol，表明有效成分与对应核心靶点有良好的结合能力。特别是槲皮素和山柰酚与AKT1的结合活性较强，结合能均为-9.2 kcal/mol，这进一步表明萸精降糖方在治疗T2DM方面具有较高的可信度。

4 结语

综上所述，研究初步预测了陕西优势药食同源中药材萸精降糖方治疗2型糖尿病的潜在有效成分、核心靶点和作用机制。该方可能通过多成分、多靶点、多通路等协同作用防治T2DM。然而，笔者的研究还存在一定的局限性。仅从网络药理学和分子对接的层面探讨了萸精降糖方对T2DM的作用。今后，研究的结果还需要在药理实验等方面进一步研究和验证。