急性脊髓损伤（SCI）是1种破坏性的疾病，多由于各种外力因素（车祸、外伤等）导致脊髓部位严重受损，常伴有严重的运动、感觉、自主神经功能障碍或永久性残疾^[1]。SCI是严重的公共卫生问题，全球总发病率为100.5例/百万人，每年约有768 473例新发SCI患者^[2]。该病具有高致残率、高致死率的特点，对患者个人、家庭、社会均造成严重的负面影响，但目前仍无明确的治疗方法^[3]。

脊髓微环境是神经细胞、内皮细胞、免疫细胞等正常代谢活动所形成的环境，炎性微环境主要由中性粒细胞、小胶质细胞、巨噬细胞以及多种炎性因子组成。研究发现^[4]，SCI后会在局部继发性产生大量炎性因子，进而募集血液中的单核细胞以及巨噬细胞到损伤局部区域影响微环境中促炎因子与抗炎因子比例失衡，在局部形成炎性微环境，加重神经元、内皮细胞等凋亡或坏死、抑制轴突再生、损伤血脊髓屏障等，不利于神经功能恢复，因此如何调节SCI后微环境中促炎因子与抗炎因子的平衡、抑制炎性微环境的产生对神经功能的恢复至关重要。Toll样受体4（TLR4）属于机体固有免疫系统的感受器，可以激活下游髓样分化因子88（MyD88）/核转录因子κB（NF-κB）信号通路参与炎性或免疫性疾病进展^[5]。多项研究^[6]证实大鼠SCI模型血清以及脊髓组织在损伤后24 h至1周内白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等细胞因子浓度均上调，而抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路可以明显降低炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α的释放，减少炎性反应的发生，有助于调节SCI后炎性微环境的平衡^[7]。

针灸疗法可以有效改善SCI后神经运动功能损伤，已成为其主要治疗方法之一^[8]。国医大师贺普仁教授根据多年临床经验，总结出“病多气滞，法用三通”的学术思想。他所挖掘的火针疗法为传统针灸疗法之一，具有针和灸的双重作用，归属于“贺氏三通法”中的“温通”法，可以有效治疗中枢神经系统疾病，在SCI的治疗中也发挥重要作用^[9]。课题组前期研究发现火针疗法“温通效应”可以显著提高SCI大鼠BBB评分促进神经运动恢复，且疗效优于毫针组及艾灸组，其机制可能是通过促进热休克蛋白60表达升高，调控髓细胞触发受体2（TREM2）蛋白表达，介导M1/M2小胶质细胞活化平衡进而维持免疫微环境稳态^[10]。但火针“温通效应”是否可以通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路改善炎性微环境尚不可知。因此研究拟在红外成像的基础上，进一步观察火针疗法“温通效应”对TLR4/MyD88/NF-κB通路的影响，探索该疗法对SCI急性期炎性微环境的作用，为明确火针疗法改善SCI的作用机制提供部分实验依据。

1 材料与方法 1.1 实验动物与分组

选取健康SPF级SD雌性大鼠24只，体质量约220~240 g，自北京维通利华实验动物技术有限公司购买（许可证号：SCXK（京）2016-0006）；动物均饲养于天津市南开医院动物中心（许可证号：SYXK（津）2020-0008）。造模前将大鼠在适宜的温度（20~25 ℃）和湿度（50%±10%）情况下喂养1周，每天更换垫料、食物和饮水。所有大鼠适应性喂养1周后随机分为4组：空白组、假手术组、造模组、火针组，每组6只，干预后于1 d对各组大鼠进行相关检测。研究严格遵循中华人民共和国科学技术部2006年《关于善待实验动物的指导性意见》中的相关规定，且已经通过天津市南开医院实验动物伦理委员会批准（批准编号：NKYY-DWLL-2022-047）。

1.2 主要试剂及仪器

异氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），TNF-α、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-4（IL-4）、IL-6、白细胞介素-10（IL-10）大鼠酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒，TLR4抗体（Proteintech），MyD88抗体（CST），p-NF-κB抗体（CST）。

小动物呼吸麻醉机（中国深圳瑞沃德生命科技有限公司，R 530），病理切片机（中国上海徕卡仪器有限公司，LEiCA RM2245），电动颅脑脊髓损伤撞击仪（中国安徽耀坤生物科技有限公司，ZL-008），Infi Ray红外测温手机热像仪（中国烟台艾睿光电科技有限公司，T3S），酶标仪（中国北京伯辉生物科技有限公司，CMax Plus），高速冷冻离心机（中国上海力申科学仪器有限公司，Neofuge 1600R），贺氏细火针（直径为0.3 mm，购自北京贺氏三通中医专科门诊部），Thermo液氮罐（美国赛默飞世尔公司）。

1.3 动物造模

采用小动物麻醉剂，运用异氟烷气麻大鼠后，采用课题组前期造模方法，改良的Allen’s法制备SCI模型^[11]，撞针撞击大鼠暴露的T 9、T10段脊髓后，大鼠尾巴出现痉挛性摆动、双下肢出现回缩样抽动、呈弛缓性瘫痪视为造模成功。模型组、火针组均进行造模处理，假手术组仅摘除胸椎T 9、T10棘突及部分椎板。造模成功后每天挤压排尿3次直至其反射性膀胱排空建立。

1.4 干预方法 1.4.1 穴位选取

研究穴位选取参照中国针灸学会制定的《实验动物常用穴位名称与定位第2部分：大鼠》^[12]及《实验针灸学》^[13]选取穴位。取SCI模型大鼠损伤部位的上下端各两个棘突间隙，即T7、T8和T11、T12以及左右各旁开0.5 cm位置，共8个穴，12个针刺点。

1.4.2 治疗方法

假手术组：仅做T 9、T 10棘突以及部分椎板的切除术，在相同时间给予和火针组相同强度的抓取、固定，但不进行火针干预。

造模组：在相同时间给予和火针组相同强度的抓取、固定，但不火针干预。

火针组：选用贺氏细火针，用碘伏棉签充分消毒针刺部位，术者持针置于酒精灯外焰（即火焰的外上1/3）处，将针体烧至通红，然后迅速点刺相应腧穴，快进快出，进针深度为3~5 mm，每24 h针刺1次。

1.5 观察指标及检测方法 1.5.1 应用红外成像技术观察各组大鼠体表温度变化

在火针干预前、干预后即刻、干预后10 min、干预后20 min、干预后30 min共5个时间点用红外测温手机热像仪观察火针对SCI大鼠损伤局部体表温度的影响。

1.5.2 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测SCI模型大鼠脊髓组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白的相对表达量

每组取6只大鼠脊髓组织各30 mg，用0.9%氯化钠溶液漂洗后，放入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中进行充分裂解，待研磨后，在4 ℃预冷的高速离心机中离心30 min（离心半径16 cm），收集鲁信后上清液并用BCA蛋白质测定试剂盒测量蛋白质含量，蛋白定量后在SDS-PAGE凝胶中，对不同分子量的蛋白质进行电泳分离，然后转移到PVDF膜上，对转膜后的PVDF膜用PBS漂洗30 s及5%的BSA封闭处理1 h后，加入TLR4（1∶2 000）、MyD88（1∶1 000）、p-NF-κB（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）一抗，摇床孵育16 h，第2天使用用TBST漂洗3次，每次10 min，之后加入对应二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，TBST漂洗3次后进行ECL化学发光显影，并用Quantity One软件对条带进行灰度值分析，以目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值为目的蛋白的相对表达量。

1.5.3 ELISA法检测大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10的含量

取大鼠腹主动脉血10 mL，静置2 h后在4 ℃下以6 000 r/min速度离心15 min（离心半径16 cm），取上清液后严格按照ELISA试剂盒说明书步骤进行检测。

1.6 统计学方法

所有数据均应用SPSS 25.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，若满足正态分布且方差齐，则使用单因素方差分析，多组间比较采用LSD法检验。P＜0.05认为两组比较差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠红外成像结果

红外成像结果显示，空白组、假手术组干预后随时间变化温度表现为降低趋势；造模组在干预后20 min内温度基本趋于稳定，在治疗后30 min温度上升；火针组在火针干预后即刻温度出现明显升高，而在治疗后10 min温度开始下降，随后逐渐趋于稳定。见表 1、图 1。

2.1.1 组间比较

治疗前，各组大鼠体表温度假手术组＞火针组＞造模组＞空白组，假手术组与空白组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；造模组与假手术组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；火针组与造模组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

治疗后即刻，各组大鼠体表温度假手术组＞火针组＞造模组＞空白组，假手术组与空白组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；造模组与假手术组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；火针组与造模组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

治疗后10 min、治疗后20 min、治疗后30 min，各组大鼠体表温度假手术组＞火针组＞造模组＞空白组，假手术组与空白组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；造模组与假手术组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；火针组与造模组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.1.2 组内比较

空白组治疗后10 min与治疗后即刻相比，体表温度降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；治疗后即刻与治疗前、治疗后20 min与治疗后10 min、治疗后30 min与治疗后20 min相比，体表温度降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

假手术组治疗后即刻与治疗前、治疗后10 min与治疗后即刻相比、治疗后20 min与治疗后10 min，体表温度降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；治疗后30 min与治疗后20 min相比，体表温度降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

造模组治疗后即刻与治疗前体表温度降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；治疗后10 min与治疗后即刻相比，体表温度降低，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后20 min与治疗后10 min、治疗后30 min与治疗后20 min相比，体表温度升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

火针组治疗后即刻与治疗前体表温度升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；治疗后10 min与治疗后即刻相比，体表温度降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；治疗后20 min与治疗后10 min、治疗后30 min与治疗后20 min相比，体表温度降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 各组大鼠脊髓组织TLR4、MyD88、p-NF-κB的相对表达量

与空白组相比，假手术组大鼠脊髓组织TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；与假手术组相比，造模组大鼠脊髓组织TLR4、MyD88、p-NF-κB的相对表达量均升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；与造模组相比，火针组大鼠脊髓组织TLR4的相对表达量降低，且差异具有统计学意义（P＜0.05），而MyD88、p-NF-κB的相对表达量降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。但与假手术组相比，火针组MyD88、p-NF-κB相对表达量比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见图 2。

2.3 各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10的含量结果

1）TNF-α：与空白组相比，假手术组大鼠血清的TNF-α含量差异无统计学意义（P＞0.05）；与假手术组相比，造模组大鼠血清的TNF-α含量升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与造模组相比，火针组大鼠血清的TNF-α含量降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。2）IL-1β：与空白组相比，假手术组大鼠血清的IL-1β含量差异无统计学意义（P＞0.05）；与假手术组相比，造模组大鼠血清的IL-1β含量升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与造模组相比，火针组大鼠血清的IL-1β含量降低，差异无统计学意义（P＞0.05）；但与假手术组相比，火针组大鼠血清的IL-1β含量差异比较无统计学意义（P＜0.05）。3）IL-4：与空白组相比，假手术组大鼠血清的IL-4含量差异无统计学意义（P＞0.05）；与假手术组相比，造模组大鼠血清的IL-4含量升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与造模组相比，火针组大鼠血清的IL-4含量升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。4）IL-6：与空白组相比，假手术组大鼠血清IL-6含量差异无统计学意义（P＞0.05）；与假手术组相比，造模组大鼠血清IL-6含量升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与造模组相比，火针组大鼠血清IL-6含量降低，差异无统计学意义（P＞0.05）；但与假手术组相比，火针组大鼠血清IL-6含量差异比较无统计学意义（P＜0.05）。5）IL-10：与空白组相比，假手术组大鼠血清IL-10含量差异无统计学意义（P＞0.05）；与假手术组相比，造模组大鼠血清IL-10含量降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与造模组相比，火针组大鼠血清IL-10含量升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图 3。

3 讨论

SCI后常出现损伤节段以下运动、感觉等功能丧失，临床多表现为肢体瘫痪、行走不稳等。中医中并无“脊髓损伤”这一病名，但早在《素问·痿论》中便提出痿证的概念，可表现为四肢、躯体筋脉肌肉迟缓无力，伴有肢体麻木萎缩等；另外在《灵枢·寒热病》中记载：“身有所伤，血出多……若有所堕坠，四肢懈惰不收，名曰体堕。”因此可以根据其症状将其归于中医学“痿证”“体堕”“瘫痪”范畴。

火针最早在《黄帝内经》中被称为“燔针”“大针”，其刺法称为“焠刺”“劫刺”等。首届国医大师贺普仁教授遍览古籍同时结合自己多年临床经验，提出了“病多气滞，法用三通”的核心学术思想，创立了包括微通法、温通法、强通法在内的“贺氏针灸三通法”。其中火针疗法因结合了温热及针刺的双重功效，属于“温通法”的重要内容，具有扶正助阳、温通经脉、祛邪引热的作用^[14]。

SCI多由跌扑损伤等外伤所致，主要病机为气滞血瘀，经脉不通。因此其治法当以行气活血、通经活络为主。《素问·调经论》言：“血气者，喜温而恶寒，寒则泣不能流，温则消而去之。”火针兼具针刺与温热的双重功效，可以以温促通，起到温经通络、行气活血之功。另外明朝高武所著《针灸聚英》也明确提出：“凡治瘫痪，尤宜火针易获功效。”^[15]强调了火针疗法在瘫痪疾病中的重要性。贺教授临床上对SCI患者常火针与毫针联合应用，经过长时间治疗后可以明显改善患者感觉与运动功能障碍。课题组前期在此基础上进行了一系列基础研究，发现火针可以促进SCI大鼠神经功能的恢复，改善下肢运动功能障碍^[16]，其机制可能是与降低Caspase-3、p38MAPK表达抑制神经细胞凋亡^[17-18]、调控Wnt/ERK通路促进神经干细胞向神经元分化^[19]等相关。

炎性反应所产生的大量炎性破坏是继发性损伤的主要成分之一，在SCI中处于核心地位，其对机体产生的不良影响远大于原发性损伤^[20]，这一过程炎性小体活化并向损伤区域渗透聚集，诱导免疫细胞合成并释放重要的炎症反应细胞因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α等，形成1个持续的炎性微环境，这种持续的炎性微环境会进一步加重神经细胞凋亡、内皮细胞损伤、血脊髓屏障破坏、抑制轴突再生等，不利于SCI后神经功能的恢复^[21]。TLR4是Toll样受体家族中的一员，在调节炎症反应中发挥重要作用，并可介导神经炎症疾病，通过激活下游的关键衔接蛋白MyD88，导致下游NF-κB的激活，并随后参与产生神经毒性相关的炎性细胞因子，如TNF-α、IL-1β等^[22]。研究发现，SCI后TLR4/MyD88/NF-κB均升高，且相关炎性因子含量增加，而抑制该条通路可以有效降低炎性因子含量，改善炎性微环境，促进神经功能恢复^[23-24]。

红外热成像又被称为温差摄像，是利用红外辐射照相原理来研究人体温度变化及其分布形态的一种现代物理学无创功能性检测技术。在火针临床研究中，红外热成像技术可灵敏反应局部炎症的增退情况，并能一定程度体现血液循环情况^[25]。Kopp等^[26]研究发现，急性SCI后会促使机体免疫功能低下，且与病变节段以及SCI的严重程度显著相关。研究发现，治疗前各组大鼠体表温度假手术组＞火针组＞造模组＞空白组，除火针组与造模组差异无统计学意义外，各组间差异均有统计学意义。笔者考虑原因可能如下：未造模为正常状态下大鼠体表温度；假手术组大鼠未损伤脊髓，免疫功能正常情况下切开皮肤、肌肉并切除部分棘突及椎板，体表易产生炎症反应，因此体表温度最高；而造模组与火针组均为急性SCI模型，切开皮肤、肌肉并切除部分棘突、椎板后由于免疫功能低下，因此体表温度低于假手术组。“血气者，喜温而恶寒”，针刺具有疏通经络之效，而火针兼具针刺与艾灸的双重功效，在针刺疏通经络的基础上可以以温促通，行气活血，提高疗效，此即贺氏三通法中的“温通”法。本研究火针组在干预后即刻温度明显升高，约为0.65 °，在治疗后10 min温度下降，随后逐渐趋于稳定，而造模组干预后即刻温度明显下降，约为0.28 °，之后逐渐趋于稳定。笔者认为火针干预后即刻体表温度升高，提示局部血液循环的改善，可以认为是火针火热之力进入人体发挥“温通”作用的体现。

与造模组相比，火针组TLR4的相对表达量明显降低，差异具有统计学意义；而与造模组相比，火针组MyD88与NF-κB相对表达量也降低，但差异无统计学意义。但值得一提的是，笔者发现造模组MyD88与NF-κB与假手术组相比，相对表达量差异具有统计学意义，而火针组MyD88与NF-κB与假手术组相比差异无统计学意义，因此笔者认为火针组MyD88与NF-κB的相对表达量与造模组相比有一定的降低趋势。同时我们发现在血清促炎因子含量方面：与造模组相比，火针组血清TNF-α的含量降低，差异具有统计学意义；与造模组相比，火针组血清中IL-1β、IL-6的含量降低，尽管差异无统计学意义，但与MyD88及NF-κB相似，造模组血清IL-1β及IL-6的含量与假手术组相比差异具有统计学意义，而火针组血清IL-1β及IL-6的含量与假手术组相比差异无统计学意义，因此也认为火针组血清IL-1β、IL-6的含量与造模组相比有一定的降低趋势。在抗炎因子方面：与造模组相比，火针组血清IL-4、IL-10含量均明显升高，差异具有统计学意义。这提示火针疗法“温通效应”可能通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路调节促炎/抗炎因子的平衡从而发挥改善SCI后炎性微环境的作用。

综上，火针疗法“温通效应”可以改善SCI大鼠急性期炎性微环境，其作用机制可能与其抑制TLR4、MyD88、NF-κB蛋白的表达，调控促炎/抗炎因子的平衡有关^[27]。本研究为火针疗法治疗SCI提供了一定的科学依据。红外热成像技术可以较为灵敏的反映局部温度变化，揭示局部炎症的严重程度，反应血液循环情况，在一定程度上可以作为火针疗法“温通效应”的直观体现。但火针疗法“温通效应”仍需进一步深入研究，以明确火针的“温”作用在人体后具体起效机制以及火针“通”的具体体现。此类问题的阐释将有助于更全面的理解火针疗法的疗效和作用原理。