新型冠状病毒感染于2019年出现，在全球范围内造成了大量的感染和死亡病例，其临床表现为呕吐、咳喘、发烧、腹泻以及肺部疾病等^[1-2]，许多患者在急性感染控制后出现涉及周身器官，甚至持续很长时间的不同程度的症状，称为“长新冠”^[3]。中药含有多种药效成分，可作用于多个靶点，通过多个途径^[4]，在预防、治疗新型冠状病毒感染、“长新冠”中发挥着不容小觑的作用，参与确诊病例的比例高达92%^[5-7]。

2022年1月26日天津市发布《天津市新冠肺炎恢复期中西医结合康复方案（试行）》，旨在指导新型冠状病毒感染患者出院后的康复工作。其中，清金益气颗粒作为一种中药复方制剂，临床使用效果显著，被推荐为药物康复方法之一^[8]。《中医药治疗新型冠状病毒感染核酸/抗原转阴后常见症专家共识》中明确生脉散合平胃散加减（清金益气方）为通用方药。主要功效为益气养阴，健脾和中，清热祛湿，可用于“长新冠”的治疗。

中药成分复杂，仅从单一指标成分分析无法全面反映其质量特征^[9]，且不同产地以及批次的饮片对物质基准皆有影响^[10-11]，指纹图谱能够全面展示中药中成分特征以及质量变化情况，可以直观地评价中药的一致性和稳定性^[12]。而化学模式识别注重差异性，二者结合能够全面地反映中药数据同时揭示不同饮片间的差异性^[13-15]。目前，对清金益气方的质量控制仅进行了含量测定的研究，对指纹图谱的研究尚未见报道。文章建立了清金益气方物质基性高效液相色谱法（HPLC）指纹图谱研究方法，以期为清金益气方物质基准质量标准的建立奠定基础。

1 材料 1.1 仪器

HPLC-1260-Ⅱ-DAD型高效液相色谱仪（美国安捷伦），XP205型十万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），AX224ZH型万分之一电子分析天平（奥豪斯仪器有限公司），型号为KQ-400B的超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），N-1210型旋转蒸发仪（日本京东理化股份公司），DZKW-S-6电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器有限公司），BGZ-140型鼓风干燥箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司），FDU-2100型冷冻干燥机（日本京东理化股份公司）。

1.2 试剂与药物

对照品：戟叶马鞭草苷（批号：20101701；纯度：98.98%）、马鞭草苷（批号：AF21052409；纯度：99.13%）均购自成都埃法生物科技有限公司；黄芩苷（批号：P20A9F59353；纯度：99.6%）、汉黄芩苷（批号：R27M10F89336；纯度：99.8%）、橙皮苷（批号：K09S11L123847；纯度：98.1%）均购自上海源叶生物科技有限公司；异阿魏酸（批号：111698-201103；纯度：99.2%）、甘草酸铵（批号：110731-202021；纯度：96.2%）均购自中国食品药品检定研究院。试剂：色谱纯乙腈、色谱纯磷酸、色谱纯甲醇（美国Thermo Fisher公司），甲酸（天津市华东试剂厂），水为超纯水；饮片（华润三九医药股份有限公司研发中心）。10批饮片组合见开放科学（资源服务）标识码（OSID）。

2 方法与结果 2.1 清金益气方物质基准的制备

取处方量的人参、麦冬、五味子（捣）、茯苓、清半夏、玄参、麸炒苍术、陈皮、甘草、柴胡、升麻、薏苡仁、黄芩、马鞭草、芦根、淡竹叶。以上16味，水煎煮两次，第1次60 min，第2次40 min，滤过，滤液于60 ℃以下浓缩至相对密度1.02~1.10 g/mL。冷冻干燥，即得清金益气方物质基准干膏粉。

2.2 溶液的制备 2.2.1 供试品溶液制备

精密称取0.50 g物质基准干膏粉于锥形瓶中，精密移取25 mL的70%甲醇溶液复溶，摇匀密封后称质量，于400 W，超声20 min，取出后，于室温放冷，补足失质量，摇匀后静置并监测其溶解状态，将上清液过0.22 μm有机微孔滤膜，即得。

2.2.2 单味药及阴性供试品溶液

按处方量分别称取各单味药饮片，按“2.1”项下制备单味药干膏粉，按“2.2.1”项制备单味药样品溶液，同法制得分别缺各单味药的阴性样品溶液。

2.2.3 对照品溶液制备

精密称取一定量对照品，用甲醇溶解并配制为每1 mL含9.260 μg异阿魏酸、36.27 μg橙皮苷、15.22 μg甘草酸铵、107.77 μg黄芩苷、19.60 μg戟叶马鞭草苷、10.00 μg马鞭草苷、43.91 μg汉黄芩苷的混合对照品溶液。

2.3 色谱条件

色谱条件为：以Agilent 5 TC-C-18（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，进样量为10 μL，柱温为30 ℃，流速为1.0 mL/min，以流动相0.1%磷酸水（A）-乙腈（B）进行洗脱，后运行时间设置为15 min，在237 nm下进行检测。液相洗脱梯度，见表 1。

2.4 方法学考察 2.4.1 精密度实验

按“2.3”项的色谱条件将同一待测供试品溶液连续进样6次进行分析，参照峰选择12号峰（汉黄芩苷），相对保留时间和相对峰面积的结果显示，13个共有峰的相对峰面积的RSD均小于3%，相对保留时间的RSD均小于0.2%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性实验

按“2.2.1”项下的方法用同一批待测物质基准干膏粉制备6份供试品溶液，色谱条件和精密度试验一致，结果显示，13个共有峰的相对峰面积的RSD均小于4%，相对保留时间的RSD均小于0.4%，表明重复性良好。

2.4.3 稳定性实验

按“2.3”项色谱条件将同一待测供试品溶液，分别在0、3、6、9、12、24、36、48 h进样分析，参照峰选择12号峰（汉黄芩苷），结果显示，各共有峰相对峰面积的RSD均小于4%，相对保留时间的RSD均小于0.2%，表明该方法在48 h内稳定性良好。

2.5 指纹图谱的建立 2.5.1 共有峰的确定

随机组合10批次的清金益气全方，将组合好的饮片按“2.2.1”项制备10批清金益气方物质基准溶液，将制备好的供试品溶液按“2.3”项下色谱条件进样测定，用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》，对10批清金益气方物质基准色谱图进行评价分析，将图谱中峰形好、分离度好且含量高的13个色谱峰作为清金益气方物质基准的指纹图谱共有峰。

2.5.2 参照峰的选择

在指纹图谱中，汉黄芩苷的色谱峰的峰形较好、分离度良好，保留时间及峰面积大小适中，因此，选择汉黄芩苷作为参照峰。

2.5.3 相似度评价

用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版）》对10批物质基准指纹图谱进行评价，参照图谱选择S1号色谱图，设置中位数法、0.1 min时间窗宽度，采用多点校正法自动生成对照图谱，生成了10批清金益气方物质基准指纹图谱共有模式图，见图 1；并计算相似度，10批物质基准相似度均≥0.9，表明该物质基准制备工艺稳定可行。

2.5.4 共有峰的指认

将混合对照品色谱图与清金益气方物质基准色谱图进行对比，可指认出1、2、3、7、8、12、13号峰分别为戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、异阿魏酸、橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸铵。见图 2。

2.5.5 共有峰的归属

通过进样分析清金益气方物质基准样品溶液、混合对照品溶液、及阴性样品溶液，可以发现色谱峰1（戟叶马鞭草苷）、2（马鞭草苷）号来自马鞭草，色谱峰3（异阿魏酸）来自升麻，色谱峰4、13（甘草酸铵）号来自甘草，色谱峰5、8（黄芩苷）、9、11、12（汉黄芩苷）号来自黄芩，色谱峰7（橙皮苷）来自陈皮，色谱峰6号来自马鞭草。在13个共有峰中，没有人参、麦冬、五味子（捣）、茯苓、玄参、清半夏、麸炒苍术、柴胡、薏苡仁、芦根、淡竹叶的特征峰，见图 3、图 4。

2.6 化学模式识别 2.6.1 主成分分析

本研究运用SIMCA-P+14.1（Demo）软件，变量选择共有峰峰面积，进行主成分分析^[16]，见图 5。10批样品被划分为2类：P6、P7、P9、P10为一类，其余批次的为一类。用SPSS 21.0软件，并得到了主成分因子的特征值和方差贡献率，见表 2。结果显示，研究提取出4个主成分，4个主成分的累计方差总贡献率为93.054%，表明4个主成分代表性良好，涵盖了样品共有成分的大部分信息，可用于清金益气方的质量评价。结合旋转后公共因子载荷矩阵分析，结果见表 3。以载荷的绝对值＞0.8为准^[17]，结果表明主成分1主要反映了共有峰5（黄芩）、8（黄芩苷）、11（黄芩）的信息，主成分2反映了共有峰3（异阿魏酸）、7（橙皮苷）的信息，主成分3反映了共有峰1（戟叶马鞭草苷）、峰4（甘草）、峰13（甘草酸铵）的信息，主成分4反映了共有峰10（黄芩）的信息。表明清金益气颗粒剂的质量受多种成分的影响，如黄芩、马鞭草、升麻、甘草、陈皮。

2.6.2 正交偏最小二乘判别分析

将10批物质基准的共有峰峰面积导入SIMCA-P+14.1（Demo）软件进行进行分析。可得得分矩阵图，如图 6，由得分矩阵图可发现10批物质基准可聚为2类。P6、P7、P9、P10聚为1类，其余批次聚为1类。这与主成分分析分类结果一致。结合OPLS-DA载荷散点如图 7以及OPLS-DA的VIP值如图 8分析，以VIP值＞1为标准筛选出差异性组分，可以发现差异性组分排序依次是峰2（马鞭草苷） > 峰6（马鞭草） > 峰11（黄芩） > 峰1（戟叶马鞭草苷） > 峰5（黄芩）。这些峰归主要归属于黄芩以及马鞭草两味药，因此，不同批次的黄芩以及马鞭草导致的质量差异是影响清金益气方物质基准质量稳定的关键因素。

3 讨论

10批物质基准相似度评价其相似度良好。由PCA、OPLS-DA分析可将10批物质基准分为两类，清金益气方物质基准的质量受多种成分的共同影响，同时分析可发现黄芩以及马鞭草质量差异与不同批次物质基准的差异有一定相关性。而该差异是由于不同批次的黄芩马鞭草间的质量差异引起的，因此若要保证清金益气方质量的稳定就需要保证黄芩和马鞭草质量的稳定。

4 小结

中药成分丰富，而模糊性、整体性是指纹图谱的突出性特征，因此指纹图谱可以用于评价中药的质量情况^[18]，研究基于此出发点，建立了稳定的清金益气方物质基准指纹图谱方法，可全面反映清金益气方物质基准的化学特征。经过相似度分析，10批物质基准相似度良好，特征性强，该方法简单可行，重复性良好^[19]。同时结合PCA、OPLS-DA进行评价，将10批物质基准分为2类，并找出引起分类差异的4个主成分以及影响物质基准质量的主要饮片：黄芩和马鞭草，使研究更加全面，为完善清金益气方物质基准的研究提供依据^[20]。