桑叶为桑科植物桑Morus alba L.的干燥叶，性寒；味甘、苦；归肺、肝经；具有疏散风热，清肺润燥，清肝明目的功效^[1]；临床上用于治疗风热感冒，肺热燥咳等症^[2]，是中医清热解毒之要药^[3-4]。桑叶始载于《神农本草经》，在中国具有悠久的食用及药用历史，是集食用、药用、保健等多种用途为一体的天然绿色食品。现代研究表明，桑叶具有抗氧化^[5]、抗衰老^[6]、降血糖^[7-8]、调血脂^[9]和抗肿瘤^[10]等多种药理作用。

桑叶作为药食同源中药^[11]，其质量优劣对于临床用药有效性与食用安全性具有较大影响^[12]。中国桑树种质资源丰富，分布广泛，是世界上桑种最多的国家。由于地理条件、气候和环境等因素影响，不同产区所产桑叶不免存在质量不一的问题，建立全面合理的桑叶质量评价方法非常重要。基于此，研究将超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱、化学模式识别技术与指标成分定量相结合，从多角度出发，对不同产地桑叶质量进行评价，为桑叶药材质量提升与应用提供理论依据。

1 仪器与材料 1.1 仪器

超高效液相色谱仪（美国安捷伦公司，Agilent 1290）；G3KT18273型旋涡混合器（赛默飞世尔科技公司）；十万分之一天平（波兰Radwag公司）；超纯水制备仪（Millipore公司）；超声波清洗机（天津知著科技有限公司）。

1.2 材料

甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，美国Fisher公司）；标准对照品绿原酸（批号：DST221010-021）、异槲皮苷（批号：DSTDY000601）、紫云英苷（批号：DSTDZ000102）、新绿原酸（批号：DSTDX001505）、芦丁（批号：DSTDL001702）、咖啡酸（批号：DST191030-013）、隐绿原酸（批号：DST221220-035）和山奈酚-3-O-芸香糖苷（批号：DST200619-075），以上标准对照品由成都德思特生物技术有限公司提供，纯度均大于98.0%。桑叶药材来源信息见表 1。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱：CORTECS UPLC C₁₈色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；流动相：A相为0.1%甲酸水，B相为乙腈；梯度洗脱，洗脱梯度：0~20 min，5%~21%B；流速、柱温、进样量和检测波长分别为：0.3 mL/min、35 ℃、2 μL和350 nm。

2.2 配制标准对照品溶液

取前述8种标准对照品适量，十万分之一天平精密称定，以80%甲醇对所称标准品进行溶解，最终配制成1 mg/mL的溶液，于4 ℃冰箱储存。

2.3 制备供试品溶液

精密称取桑叶药材粗粉（过三号筛）200.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加80%甲醇定容至容量瓶刻度线，超声处理1 h（300 W，40 kHz），冷却，补足失质量，摇匀，过微孔滤膜（0.22 μm）即得供试品溶液。

2.4 桑叶UPLC指纹图谱的建立 2.4.1 精密度实验

取第13批次桑叶粗粉，制备供试品溶液，连续进样6次，以第9号芦丁色谱峰为参照色谱峰（S），计算得到各共有峰相对保留时间的相对标准偏差（RSD_Rt）小于0.43%，相对峰面积的相对标准偏差（RSD_S）小于2.80%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性实验

取第13批次桑叶粗粉，平行制备6份供试品溶液，进样测定，以第9号芦丁色谱峰为参照峰（S），计算得RSD_Rt小于2.12%，RSD_S小于4.30%，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性实验

取第13批次桑叶粗粉，制备供试品溶液，在0、2、4、8、12、24 h时间点下分别进样，以第9号芦丁色谱峰为参照峰（S），计算得RSD_Rt小于1.10%，RSD_S小于4.92%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.4 桑叶UPLC指纹图谱的建立与相似度评价

将16批桑叶UPLC色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（国家药典委员会，2012）”，以第1批样品色谱图为参照图谱，采用平均数法生成对照图谱，建立16批桑叶药材的叠加指纹图谱以及对照指纹图谱（R），见图 1 A。14个峰被标定为共有峰，通过比对标准对照品溶液的色谱图，见图 1 B，共8个成分被指认，分别为新绿原酸（1号峰），绿原酸（2号峰），咖啡酸（3号峰），隐绿原酸（4号峰），芦丁（9号峰），异槲皮苷（10号峰），山奈酚-3-O-芸香糖苷（12号峰）和紫云英苷（13号峰）。相似度分析结果见表 2，由表可知，结果均在0.962以上，初步说明16批样品的化学成分一致性较高，质量均一稳定。

2.4.5 化学计量学分析

化学计量学分析模型由SIMCA-P14.1（Umetrics, Umea, Sweden）建立，其统计学特性通过R²X、R²Y和Q²进行评估。

2.4.5.1 主成分分析（PCA）

采用SIMCA 14.1软件，以16批桑叶药材的14个共有峰的峰面积为变量进行PCA分析。R²为0.978，Q²为0.968，表明该模型具有较高的解释能力和预测性能。PCA得分图结果显示，16批桑叶药材可分为3类，S5、S6药材聚为第一类，S1、S2、S7-S9、S12-S15桑叶药材聚为第二类，S3、S4、S10、S11和S16桑叶药材聚为第三类。PCA结果显示，位于太湖流域的江苏产桑叶单独聚为第一类，位于中国中部地区的安徽、河南、山西和华北地区的河北产桑叶聚为第二类，华中地区的湖北、华南地区的广西和华东地区的山东产桑叶聚为第三类。由此可知，不同产地桑叶质量与地理来源相关性较大。此外，结合下文含量测定结果可知，在此实验所评价的16批桑叶中，第一类江苏产桑叶所测得化合物总含量最高，安徽、河南、山西和河北产桑叶次之。具体见图 2 A与后文含量测定部分。

2.4.5.2 偏最小二乘-判别分析（PLS-DA）

根据主成分分析结果，以共有峰峰面积为变量进行PLS-DA分析。该模型具有较好的预测能力（R²X，R²Y，Q²值分别为0.992，0.960，0.737），可以被用于评价与分析不同产地桑叶药材间的质量差异。通过PLS-DA模型得分图（图 2B）可知，不同产地桑叶药材也明显分为3类，与PCA结果一致。对两个分类变量进行了200次置换检验，如图 2C所示，Q²点所在回归线与Y轴交于0以下且左侧点的所有排列值均远低于右上角原始点的值（R²=0.247＜0.3，Q²=-0.412＜0.05），表明该模型没有过拟合，有效可靠。

为进一步筛选区分不同产地桑叶药材间的标志性成分，选取了变量投影重要度（VIP）＞1的成分作为差异性成分。由图 2D可知，差异显著性排序为1号峰（新绿原酸）＞4号峰（隐绿原酸）＞3号峰（咖啡酸）＞14号峰＞11号峰。

2.5 含量测定 2.5.1 线性关系考察

精密量取各对照品储备液适量，使用80%甲醇依次稀释，得到标准曲线中各浓度混合对照品溶液，取各上述溶液进样分析，记录相应峰面积，以色谱峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），绘制含量测定的标准曲线，计算线性回归方程，结果见表 3。

2.5.2 精密度实验

取第13批次桑叶粗粉，制备供试品溶液，连续进样6次，计算得8个待测成分的峰面积RSD均小于0.26%，表明仪器日内精密度良好。每天重复进样2次，连续进样3 d，计算得8个待测成分峰面积RSD均小于0.45%，表明仪器日间精密度良好。

2.5.3 重复性实验

取第13批次桑叶粗粉，平行制备6份供试品溶液，进样测定，计算得8个待测成分的含量RSD分别均小于2.19%，表明该方法重复性良好。

2.5.4 稳定性实验

取第13批次桑叶粗粉，制备供试品溶液，在0、2、4、8、12、24 h时间点下分别进样，计算得8个待测成分的峰面积RSD均小于分别为3.38%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.5 加样回收率实验

精密称取6份桑叶粉末100.0 mg，分别加入各对照品适量，平行制备6份供试品溶液，进样测定，记录峰面积，计算新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷和紫云英苷的平均加样回收率，依次为107.68%、103.07%、102.21%、103.45%、100.56%、99.95%、111.23%、102.98%，RSD值均小于1.49%，表明该方法的准确度符合要求。

2.5.6 含量测定

取各批次桑叶粉末制备供试品溶液，进样分析，按照外标法计算各成分含量，结果见表 4。

3 讨论 3.1 提取方式和提取条件的优化

研究考察了提取方式对主要色谱峰的影响，结果显示回流与超声提取法对主要色谱峰的影响并不显著。在绿色化学的理念下为提高效率，研究采用超声提取法。同时，研究还考察了提取时间（0.5、0.75、1、1.5 h）、提取溶剂（30%甲醇、50%甲醇、80%甲醇、甲醇）对色谱峰的影响。结果显示，以80%甲醇为提取溶剂，提取时间为1 h所得色谱峰响应较强且数量最多。

3.2 色谱条件的优化

研究考察了流动相、柱温和流速对色谱峰分离的影响。结果显示，当柱温为35 ℃，乙腈-0.1%甲酸水为流动相在0.3 mL/min流速下进行检测时，基线平稳，20 min内即可完成主要色谱峰的良好分离。

研究将UPLC指纹图谱、化学计量学和指标成分含量测定相结合，从多角度综合评价了不同来源桑叶的质量。该方法专属性强，分析时间短，可为桑叶药材质量标准的提升与临床应用提供参考。