清金益气颗粒为张伯礼院士团队赴石家庄指导中西医结合抗疫时研制的新型冠状病毒感染患者恢复期用药，全方由人参、麦冬、五味子、黄芩、陈皮、甘草等16味中药组成，适用于疫病后短期症状，气阴两虚、脾虚失运、余邪未尽证^[1]。方中人参益气生津、补脾益肺，麦冬养阴润肺、益胃生津，五味子收敛固涩、益气生津，三药相伍，共为君药；麸炒苍术燥湿运脾，陈皮理气和胃，甘草益气补中而实脾，茯苓健脾渗湿，清半夏燥湿化痰，共为臣药；黄芩清热燥湿，芦根清热泻火、生津止渴，玄参清热凉血、滋阴降火，淡竹叶清热泻火、除烦止渴，薏苡仁健脾利水、渗湿解毒，升麻、柴胡升阳解毒，马鞭草散瘀解毒，该八味共为佐药；甘草兼为使药，使诸药调和。诸药合用，共奏益气养阴，健脾和中，清热祛湿之效。有研究发现，清金益气方可通过抑制气管壁增厚、肺实质和气道中的胶原纤维含量的增加，减少黏液生成，改善气道炎症中的气道重塑，从而减轻烟熏联合脂多糖诱导的慢性阻塞性肺疾病对小鼠肺部的损伤^[2]。临床研究表明，清金益气颗粒可改善新冠病毒引起的咳嗽、咯痰、气短、腹胀、疲劳等症状，暂未发现明显不良反应^{[1, 3]}。鉴于其在新型冠状病毒感染患者恢复期治疗中发挥的显著作用，当前已被纳入《天津市新冠肺炎恢复期中西医结合康复方案（试行）》、《中医药治疗新型冠状病毒感染核酸/抗原转阴后常见症专家共识》等中作为推荐用药^[4-5]。

目前，清金益气颗粒含量测定方法暂无法定执行标准，故本研究采用超高效液相色谱（UPLC）法，建立同时测定清金益气颗粒中黄芩苷、橙皮苷、甘草酸含量的方法，以期为清金益气颗粒的质量评价提供一定参考。

1 实验材料 1.1 仪器

Thermo Vanquish型超高效液相色谱仪（DAD检测器，美国赛默飞世尔科技公司），SQP QUINTIX125D-1CN型十万分之一分析天平（德国赛多利斯公司），SQP QUINTIX224-1CN型万分之一分析天平（德国赛多利斯公司），CASCADA型超纯水仪（美国颇尔公司），AS20500BT型超声波清洗仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

1.2 试剂及试药

清金益气颗粒共8批，其中1批（规格：10 g/袋，批号：21013011）来源于神威药业集团有限公司，4批（规格：每袋15 g，批号：8960001、8960003、8960005、8960006）来源于天津中新药业集团股份有限公司乐仁堂制药厂，3批（规格：每袋15 g，批号：2206002SY、2206003SY、2206004SY）来源于华润三九现代中药制药有限公司。缺黄芩阴性样品（批号：QJ22090104）、缺陈皮阴性样品（批号：QJ22083101）、缺甘草阴性样品（批号：QJ22083104），均为自制品。对照品橙皮苷（批号：110721-202220，纯度97.2%）、黄芩苷（批号：110715-202122，纯度94.2%）、甘草酸铵（批号：110731-202122，纯度94.4%），均购自中国食品药品检定研究院。甲醇（天津彪仕奇科技发展有限公司）、乙腈（天津市永大化学试剂有限公司）、磷酸（天津风船化学试剂科技有限公司）均为色谱级，水为超纯水。

2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 对照品溶液的制备

精密称定橙皮苷对照品适量，加甲醇制成浓度为0.2 mg/mL的橙皮苷对照品储备液。精密称定黄芩苷对照品及甘草酸铵对照品适量，另取橙皮苷对照品储备液20 mL，置同一100 mL容量瓶中，加70%甲醇制成橙皮苷、黄芩苷、甘草酸铵浓度分别为40、130、10 μg/mL的混合对照品溶液，摇匀，即得（甘草酸质量=甘草酸铵质量/1.020 7）。

2.1.2 供试品溶液的制备

精密称取研细后的清金益气颗粒0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密移入70%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理20 min，取出，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性样品溶液的制备

取清金益气颗粒处方药味（五味子捣碎），扣除相应缺阴性药材，依据其制法，加水煎煮两次，第1次加入8倍量水煎煮60 min，第2次加入6倍量水煎煮40 min，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩成相对密度为1.02~1.10（60 ℃）的清膏，喷雾干燥成干膏粉，按“2.1.2”项下供试品溶液制备方法分别制备缺黄芩阴性、缺陈皮阴性、缺甘草阴性样品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱为Waters CORTECS UPLC T3（2.1 mm×100 mm，1.6 μm），以0.1% 磷酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱（0~13 min，11%B；13~18 min，11%~15%B；18~35 min，15%B；35~45 min，15%~26%B；45~55 min，26%~40%B；55~60 min，40%B），流速为0.3 mL/min，柱温为30 ℃，进样体积为2 μL，甘草酸检测波长为237 nm，黄芩苷、橙皮苷检测波长为280 nm。理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于5 000。

2.3 方法学考察 2.3.1 专属性实验

精密吸取“2.1”项下溶液各2 μL，注入超高效液相色谱仪进行分析。结果如图 1所示，橙皮苷、黄芩苷、甘草酸3个色谱峰均未出现在相应阴性样品溶液图谱中，说明该方法专属性良好。

2.3.2 线性与范围

取橙皮苷、黄芩苷、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含橙皮苷152.4 μg、黄芩苷735.7 μg、甘草酸铵220.8 μg的混合储备液。精密吸取混合储备液，分别稀释成浓度为混合储备液1%、10%、25%、50%、100%的橙皮苷、黄芩苷、甘草酸铵标准溶液，在“2.2”项下色谱条件进样分析。以指标成分峰面积（Y）对标准溶液浓度（X）作标准曲线，得回归方程，结果见表 1，图 2-4。

2.3.3 精密度实验

取配制的含40 μg/mL橙皮苷、130 μg/mL黄芩苷、10 μg/mL甘草酸铵混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件重复进样6针，计算橙皮苷、黄芩苷、甘草酸峰面积RSD值，结果分别为0.3%、0.4%、0.4%，说明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性实验

精密称取研细后的2206002SY批次清金益气颗粒6份，每份0.5 g，照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，并采用“2.2”项下色谱条件进行分析，计算供试品中橙皮苷、黄芩苷、甘草酸含量RSD值，分别为0.5%、0.1%、0.7%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率实验

精密称取研细后的2206002SY批次清金益气颗粒6份，每份0.25 g，分别精密加入0.25 g清金益气颗粒中对应成分相当量的橙皮苷、黄芩苷、甘草酸铵对照品，根据“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，并采用“2.2”项下色谱条件测定，计算得橙皮苷、黄芩苷、甘草酸的平均回收率分别为90%、99%、98%，RSD值分别为4.2%、0.3%、0.3%。结果良好，表明该方法准确可靠。

2.3.6 稳定性实验

取批号为2206002SY的清金益气颗粒适量，采用“2.1.2”项下方法制备溶液，并在制备后0、3、6、9、12、15、18、21、24 h分别进样分析，计算各指标成分峰面积RSD值。结果显示，供试品溶液24 h内稳定性良好，橙皮苷、黄芩苷、甘草酸峰面积的RSD值分别为3.1%、0.3%、0.3%。

2.4 含量测定

取8批清金益气颗粒，根据“2.1.2”项下方法制备溶液，采用“2.2”项下色谱条件测定，记录清金益气颗粒中橙皮苷、黄芩苷、甘草酸的峰面积并计算含量。结果见表 2，不同批次颗粒间的橙皮苷、黄芩苷、甘草酸含量均存在一定差异，可能与颗粒装量规格，原药材采摘时间、存储方式等条件有关。

3 讨论 3.1 指标成分的选择

清金益气颗粒全方由生脉散^[6]、平胃散^[7]、普济消毒饮^[8]等经典名方加减化裁而来，以益气养阴、健脾和中、清热祛湿之法治疗新冠恢复期之气阴两虚、余热未清证。课题组前期对清金益气颗粒化学成分进行分析发现，其主要包括黄酮类、萜类、生物碱类、有机酸类等多种活性成分^[9]。方中人参、麦冬、五味子3味药虽为君药，但颗粒所含人参中人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁，麦冬中鲁斯可皂苷元，五味子中五味子醇甲含量较低，在此实验条件下不易测出，因此未进行定量分析。而方中陈皮为臣药，具有理气健脾、燥湿化痰的功效^[10]，临床上常用于治疗咳嗽痰多^[11]，其所含黄酮类成分橙皮苷具有抗炎、抗氧化、提升免疫力等作用^[12-14]。佐药黄芩为治疗肺热咳嗽之要药，黄酮类成分是其发挥药理作用的物质基础，其中又以黄芩苷含量较高^[15]，现有研究表明，黄芩苷具有抗炎、解热等作用^[16-17]。甘草甘平入脾，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效^[10]，是为臣药兼作使药，主要含有三萜皂苷类、黄酮类、多糖类等多种化学成分，其中甘草酸为甘草的重要活性成分，具有抗病毒、抗炎等作用^[18-21]。研究依据《中国药典》2020年版单味药材含量测定项下规定^[10]，以清金益气颗粒中臣药陈皮的活性成分橙皮苷、佐药黄芩的特征成分黄芩苷、臣药兼使药甘草的专属性成分甘草酸为定量控制的指标成分，以期更好地控制和反映其内在质量。

3.2 供试品制备方法的考察

研究考察了不同提取溶剂（水、30%甲醇、70%甲醇、100%甲醇）、不同提取时间（10、20、30 min）、不同超声功率（520 W（25%、50%、100%额定功率），40 kHz）对清金益气颗粒中各指标成分的提取效果。结果显示，随着提取溶剂中甲醇浓度的提高，提取效率先上升后下降，当提取溶剂为70%甲醇时，橙皮苷、黄芩苷、甘草酸含量最高；超声时间为20 min时，3个指标成分含量最高；不同超声功率对各指标成分提取效率无明显差异。综合考虑，确定供试品制备方法为以70%甲醇为提取溶剂，超声提取20 min。

高效液相色谱（HPLC）法是目前药物检测及分析最常用的方法之一，但与之相比，UPLC法具有超高效、超高分离度、超高灵敏度、低消耗等优点，能极大缩短药物检测周期，减少流动相的消耗，同时还能显著提高色谱峰分离度和检测灵敏度，更适合用于中药复方制剂复杂成分的分离与分析^[22]。基于此，研究利用UPLC建立了清金益气颗粒中指标成分橙皮苷、黄芩苷、甘草酸的含量测定方法，可定性、定量控制清金益气颗粒的质量。该方法操作简便、专属性强、稳定准确、重复性好，方法学考察结果均符合《中国药典》2020年版相关规定，可为后续优化清金益气颗粒整体控制方法、建立和完善质量标准等研究提供一定的参考依据。

4 结论

研究采用UPLC测定了8批清金益气颗粒中橙皮苷、黄芩苷、甘草酸的含量，含量测定结果表明该3种指标成分均存在一定的批间差异，说明多指标成分的质量控制对确保清金益气颗粒质量及临床用药疗效一致性具有重要意义。经方法学验证，本研究所建立的UPLC法稳定准确、重复性好，可为清金益气颗粒的质量控制提供一定的参考依据。