糖尿病肾病（DKD）是糖尿病患者常见的慢性并发症之一，具有较高的发病率和隐匿性。这种并发症会逐渐破坏肾脏的结构和功能，早期可能不易察觉，但随着时间推移，病情会逐渐加重，最终导致终末期肾病的发生，对患者的生命健康构成严重威胁^[1]。控制血糖、血压、血脂以及改善微循环是目前治疗DKD的主要手段^[1]，通常采用西药治疗，但可能会对患者产生不良反应^[2]。随着发病率逐年升高，DKD造成的社会负担逐渐加重。因此，研发能够干预并延缓DKD进展的药物是当前的研究热点之一。

在DKD的基础实验研究中，中药展现出了显著的治疗潜力^[3-4]，补阳还五汤可能通过抑制核转录因子-κb（NF-κB）信号通路改善DKD大鼠肾组织氧化应激状态和炎症损伤^[5]。另外，临床研究发现，益气养阴通络方可以改善DKD患者糖脂代谢水平，提高肾功能^[6]；益气固肾通络方可能通过改善机体的氧化应激状态，改善早期DKD患者的临床症状^[7]；肾衰宁胶囊可以改善DKD慢性肾功能衰竭3、4期患者的微炎症状态^[8]。

健脾固肾化瘀方（JPGS）由黄芪、人参、熟地黄、山茱萸、山药、芡实、金樱子、白术、当归、丹参、川芎、水蛭、酒大黄组成，具有健脾固肾、化瘀通络之功，与DKD病机相符，临床应用取得良好疗效^[9]。然而，JPGS治疗DKD的作用机制仍需进一步研究明确。本研究首先运用高脂饮食（HFD）联合链脲佐菌素（STZ）诱导DKD小鼠模型，评估JPGS对DKD小鼠的治疗作用。然后，运用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）及蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测上皮间质转化（EMT）相关因子表达情况，评估JPGS对EMT的影响。最后，采用Western Blot法检测去乙酰化酶1（SIRT1）/转化生长因子-β1（TGF-β1）/Smad通路相关蛋白表达，评估JPGS对该通路的影响。

1 材料 1.1 动物

SFP级健康雄性C57BL/6小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司[动物许可证号：SCXK（京）2019-0008]，体质量（22±2）g。饲养环境：12/12 h明暗循环，温度25 ℃，湿度50%，食物和水均可自由获取。

1.2 药品与试剂

SRT1720购自MedChemExpress（货号：HY-10532，）；JPGS由沧州中西医结合医院药剂科配制，所用中药材均采购自河北省安国中药材专业市场；自南京建成生物工程研究所购买二喹啉甲酸（BCA）试剂盒（货号：W041-1-1）、尿素氮（BUN）试剂盒（货号：C013-2-1）、Masson染液（货号：D026-1-3）、肌酐（Cr）试剂盒（货号：C011-2-1）、苏木素-伊红（HE）染液（货号：D006-1-4）、尿蛋白定量（UPQ）试剂盒（货号：C035-2-1）；自Cell Signaling Technology购买一抗：β-肌动蛋白（β-actin，货号：3700）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，货号：69319）、E-钙黏蛋白（E-cad，货号：14472）、转化生长因子-β（TGF-β，货号：3711）、波形蛋白（VIM，货号：3932）；自Abcam购买一抗：SIRT1（货号：ab189494）、紧密连接蛋白-1（ZO-1，货号：ab307799）、Smad2（货号：ab33875）、磷酸化Smad2（P-Smad2，货号：ab280888）、Smad3（货号：ab208182）、磷酸化Smad3（P-Smad3货号：ab52903）；自北京索莱宝科技有限公司购买羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）-辣根过氧化物酶（HRP）二抗（货号：SE134）；自天根生化科技（北京）有限公司购买总RNA提取试剂盒（货号：#DP419）、cDNA反转录试剂盒（货号：#KR116-02）、SYBR扩增试剂盒（货号：#P205-02）。

1.3 仪器

全自动酶标仪（货号：STSTFAX2011，Awareness Technology，美国）；PowerPac Basic电泳仪、ChemiDoc XRS凝胶成像自动分析仪（Bio-Rad，美国）；高速冷冻离心机（湖南可成）；荧光定量PCR仪（北京乐普）。

2 方法 2.1 造模、分组与给药

采用HFD联合STZ建立DKD小鼠模型。具体方法为：64只小鼠适应性喂养1周后，随机选取10只作为正常组（C）继续以常规饲料喂养，剩余54只采用HFD喂养，持续8周。禁食、不禁水12 h后，54只小鼠腹腔注射30 mg/kg的STZ，C腹腔注射等体积的1%柠檬酸钠缓冲液。3 d后尾静脉采血测定随机血糖，随机血糖≥16.7 mmol/L提示2型糖尿病模型建立成功。54只小鼠中有4只小鼠未达到2型糖尿病模型标准，故剔除，2型糖尿病模型成功率为92.6%。继续喂养，每周检测小鼠24 h尿蛋白定量（24 h-UPQ）。随机血糖≥16.7 mmol/L且24 h-UPQ≥20 mg提示DKD模型建立成功。2型糖尿病造模成功后继续喂养2周，剩余50只小鼠均符合DKD模型标准。

造模结束后，除C外，DKD造模成功的50只小鼠随机平均分为模型组（M）、SIRT1激动剂组（S）、低剂量JPGS组（JL）、中剂量JPGS组（JM）、高剂量JPGS组（JH）。

C与M每日灌胃200 μL生理盐水，S每日灌胃50 mg/kg的SRT1720，JL、JM、JH每日分别灌胃2.4、4.8、9.6 g/kg的JPGS。JPGS剂量根据人与动物体表面积折算的等效剂量比值计算得出，将中剂量设置为人的等效剂量。药物干预时间持续8周，之后收集各组小鼠24 h尿液样本、血液样本。处死后收集左侧肾脏并用4%多聚甲醛固定，收集右侧肾脏冷冻保存。

2.2 肾功能指标分析

24 h尿液样本在4 ℃条件下4 000 r/min离心10 min（离心半径10 cm），取上清液，根据24 h-UPQ试剂盒说明书测定各组小鼠24 h-UPQ水平。血液样本在4 ℃条件下3 000 r/min离心15 min（离心半径10 cm），收集血清，根据Cr与BUN试剂盒说明书检测各组小鼠Cr与BUN水平。

2.3 病理学染色

将固定好的肾脏组织脱水、包埋，制备4 μm的石蜡切片，HE与Masson染色后，在显微镜下观察肾脏组织病理形态与纤维化情况，并用相机拍摄病理图片。

2.4 RT-qPCR分析

按照总RNA提取试剂盒的标准操作流程，从肾组织中提取总RNA。根据反转录试剂盒说明书反转录获得cDNA。使用荧光定量聚合酶链反应（qPCR）法测定目的基因的mRNA表达量。目标mRNA相对于β-actin的表达量基于2^-ΔΔCT法进行计算。引物序列见表 1。

2.5 Western Blot分析

提取肾组织样本的总蛋白，使用BCA试剂盒测定其浓度，后使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离肾组织总蛋白，并将其转移到PVDF膜。为减少非特异性结合，使用5%脱脂奶粉溶液对PVDF膜进行封闭处理1 h，随后用目的蛋白抗体4 ℃孵育12 h以上，以确保抗体与目标蛋白充分结合。多次清洗后用HRP标记的二抗在室温下孵育1 h，完成孵育后对膜进行多次清洗，以去除多余试剂与未结合抗体。清洗后采用电化学发光法（ECL）显影技术对膜上的蛋白条带进行可视化处理，并通过Image J软件对结果进行定量分析。

2.6 统计学分析

采用SPSS Pro在线数据分析平台进行统计分析。所有数据均以均数±标准差（x±s）表示。采用Shapiro-Wilk检验评估数据分布的正态性。组间比较采用Student’s非配对t检验及单因素或双因素方差分析（使用Tukey’s和Bonferroni’s post-hoc检验进行多重比较）。组间方差不相等时，应用Welch校正。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 JPGS对DKD小鼠的治疗作用

肾功能检测结果显示，与C比较，DKD小鼠血清中Cr、BUN水平及24 h-UPQ水平升高；SRT1720与JPGS干预后，DKD小鼠血清中Cr、BUN及24 h-UPQ水平降低（图 1a、1b、1c）。HE、Masson染色结果显示，与C比较，DKD小鼠肾小管结构损伤、肾小球肥大增生、肾间质出现纤维样病变，而SRT1720与不同剂量的JPGS干预后，DKD小鼠肾脏病理损伤出现不同程度改善（图 1d、1e）。

3.2 JPGS对DKD小鼠肾脏EMT的影响

RT-qPCR与Western Blot检测结果显示，与C比较，DKD小鼠肾组织E-cad、ZO-1基因与蛋白表达降低，VIM与α-SMA基因与蛋白表达升高；SRT1720与JPGS干预后，DKD小鼠的上述基因与蛋白表达水平得到改善。见图 2。

3.3 JPGS对DKD小鼠SIRT1/TGF-β1/Smad通路的影响

Western Blot检测结果显示，与C比较，DKD小鼠肾组织中SIRT1表达降低，TGF-β1、P-Smad2/Smad2、P-Smad3/Smad3升高；SRT1720与JPGS干预不同程度地逆转了上述指标。见图 3。

4 讨论

DKD多归属于中医“下消”范畴，也可以根据临床症状将其归为“水肿”“尿浊”“关格”等。本病病位在脾、肾。《诸病源候论》曰：“水病无不由脾肾虚所为……周身肿满。”脾虚不能输布水谷精微，水湿内停；肾虚而开阖不利，水液泛滥肌肤，封藏失司，固摄无权，精微下泄，从而形成水肿、蛋白尿。国医大师邹燕勤教授认为，DKD的核心病机以脾肾亏虚为本，湿瘀阻络为标，强调DKD的发生、发展与脾、肾关系最为密切，湿、瘀贯穿病程始终^[10]。国医大师吕仁和教授提出“微型症瘕”病理学说，认为热、湿、痰、瘀等病理产物出现并相互胶结沉积于肾脏，阻于肾络，形成“微型症瘕”，而“微型症瘕”可以类比于细胞外基质沉积，导致肾纤维化，从而使肾脏的固摄封藏功能出现障碍，精微漏出^[11]。黄文政教授认为DKD病程较长，患者精气虚耗、精微亏虚，则血流不充，气虚而无力推动血液循环，容易形成瘀血^[12]。南征教授常从脾肾阳虚兼瘀毒论治DKD，认为消渴病阴虚日久，阴损及阳，脾肾阳虚，致脾不化湿，肾不化气，痰湿内停，久则血脉瘀阻，毒邪内生，毒损肾络^[13]。可见，“脾肾亏虚，瘀血阻滞”是DKD的核心病机。基于此，课题组根据名老中医经验创制健脾固肾化瘀方，广泛应用于临床，疗效显著^[14]。多项临床研究表明，该药可以明显改善DKD患者中医症状评分，降低尿蛋白，改善肾功能，延缓DKD进展^[15]。

DKD患者的死亡风险较未合并肾病的糖尿病患者显著增加，严重危害患者的生命健康与生活质量。肾小球系膜扩张、基底膜增厚、肾小管间质纤维化是DKD的主要病理变化^[16]。HFD联合STZ注射诱导是一种经典的DKD模型建立方法，因其能够有效地模拟DKD患者症状已经被广泛用于DKD的基础研究^[17]。在HFD诱导小鼠产生胰岛素抵抗后，对小鼠注射STZ，使其胰腺β细胞受损而坏死，进而引起肾脏损伤，模拟DKD的病理过程^[17]。24 h-UPQ、Cr、BUN是评估肾脏滤过功能的重要指标，当其升高时，意味肾脏滤过功能严重减退^[18-19]。在本研究中，DKD小鼠的肾脏病变显著，上述指标均出现异常升高，进一步证实了DKD模型建立成功。JPGS治疗后上述症状得到不同程度改善，且高剂量JPGS干预与SRT1720干预效果相近，提示JPGS是治疗DKD的潜在药物。此外，DKD小鼠肾脏表现出纤维化特征，所以本研究还就JPGS对EMT的影响进行了评估。

EMT促进DKD进程已经被广泛证实^[20]。本研究通过检测EMT相关因子（E-cad、ZO-1、VIM、α-SMA）表达以评估JPGS对DKD小鼠EMT的影响。肾纤维化是DKD后期的特征性病理改变，主要表现为细胞外基质沉积、肌成纤维细胞激活、促炎因子分泌增加、炎性细胞浸润^[21]。在EMT过程中，上皮细胞逐渐向间质细胞转化。E-cad、ZO-1是上皮细胞的主要标记物，在此过程中表达逐渐减少；VIM、α-SMA是间质细胞的主要标记物，在此过程中表达逐渐增加^[22]。本研究发现，JPGS可以上调E-cad、ZO-1表达，下调VIM、α-SMA表达，提示JPGS可以有效促进上皮细胞分化，抑制间质细胞分化，发挥抑制EMT的作用。有研究表明，黄芪的主要活性成分黄芪甲苷可以有效抑制EMT发生^[23]。丹参的主要活性成分丹酚酸A、丹酚酸B及隐丹参酮均被证实对EMT具有显著的抑制作用^[24-25]。这些有效成分的抗EMT作用可能是JPGS抑制DKD过程中EMT发展的重要靶点，而探究JPGS中其他成分的抗EMT作用及其在抑制EMT过程中的作用机制将是未来的研究重点。

有研究发现，SIRT1/TGF-β1/Smad通路在调控EMT过程中发挥重要作用^[26]。因此，本研究检测了SIRT1/TGF-β1/Smad通路相关因子（SIRT1、TGF-β1、P-Smad2/Smad2、P-Smad3/Smad3）表达以研究JPGS对此通路的影响。SIRT1作为组蛋白去乙酰化酶在机体代谢平衡及稳态调节中发挥重要作用^[27]。有研究表明，SIRT1是TGF-β/Smad信号转导的关键调节因子，上调SIRT1可以减轻TGF-β1诱导的EMT与纤维化^[28]。TGF-β1被证明是EMT最有效的诱导剂，其通过Smad信号通路导致细胞外基质沉积、肌成纤维细胞激活、促炎因子分泌，最终造成纤维化。Smad2和Smad3是TGF-β1最为重要的下游介质^[29]。高糖条件促进了TGF-β1活化^[30]，进而促进Smad2、Smad3磷酸化，使其转入细胞核以促进纤维化相关基因转录，最终导致肾纤维化^[31]。本研究发现，JPGS可以上调SIRT1表达，下调TGF-β1、P-Smad2/Smad2、P-Smad3/Smad3水平，提示JPGS可以通过SIRT1/TGF-β1/Smad通路抑制EMT从而缓解DKD肾损伤。此外，本研究采用SRT1720作为阳性对照，结果表明，JPGS发挥了与SRT1720相近的作用。有研究表明，丹酚酸A、白术内酯Ⅲ可以激活SIRT1^[32-33]，川芎嗪、隐丹参酮可以抑制TGF-β1/Smad信号通路激活^[34-35]。这些有效成分对SIRT1的激活以及对TGF-β1/Smad的抑制可能是JPGS调节SIRT1/TGF-β1/Smad通路的关键，而探索其他成分对该通路的影响将是进一步深入研究JPGS治疗DKD机制的关键。

综上所述，JPGS可以抑制SIRT1/TGF-β1/Smad通路介导的EMT，从而缓解DKD肾损伤。