糖尿病肾脏病（DKD）属于糖尿病微血管并发症之一，临床表现为进行性蛋白尿及肾功能损伤，病变可累及肾小球、肾小管、肾间质等肾脏组织，是引起慢性肾脏病的重要原因之一^[1]。在中国约有21.8%的糖尿病患者合DKD^[2]，给患者家庭造成沉重的经济负担，也是导致糖尿病患者死亡的常见原因之一^[3]。因此，亟须寻找有效的治疗方法延缓DKD的进展。

丹蛭降糖胶囊是方朝晖教授根据多年临床经验结合中药多成分、多靶点的特点研制的院内制剂，前期临床观察^[4-5]与动物实验^[6-7]均表明，丹蛭降糖胶囊具有改善肾功能、降低蛋白尿的作用，但其作用机制尚不明确。网络药理学可以对生物系统进行网络分析，选取特定信号节点进行多靶点药物分子设计，目前被广泛应用于对中药复方作用机制的研究中^[8]。本研究拟采用网络药理学方法，通过数据检索与筛选，构建“药物-化学成分-疾病-靶点”网络，以揭示丹蛭降糖胶囊治疗DKD的主要化学成分及可能的分子机制。并结合体外实验验证丹蛭降糖胶囊对DKD的药效作用，为其深入开发利用提供理论依据和数据支持。

1 网络药理学 1.1 丹蛭降糖胶囊有效成分筛选及作用靶点预测

利用本草组鉴（HERB，https://herb.ac.cn/）及中药系统药理学数据库分析平台（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）获得太子参、菟丝子、牡丹皮、泽泻、水蛭及生地黄的所有成分，依据口服利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18筛选有效成分，并用TCMSP、PubChem、SwissADME及SwissTargetPredictio数据库收集有效成分的目标靶点。将所有筛选的靶点信息利用Uniprot数据库（https://www.uniprot.org）以“Homo sapiens”为关键词对靶点进行规范，获得标准化靶点基因。

1.2 糖尿病肾病疾病靶点获取

在GeneCards数据库（http://www.genecards.org/）中搜索“Diabetic kidney disease”及“Diabetic nephropathy”，以“Relevance score≥50”为条件筛选获得DKD疾病靶点。通过OMIM数据库（http://omim.org/）、DrugBank数据库（https://go.drugbank.com/）、TTD数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）对疾病靶点进行补充。将疾病靶点与药物靶点取交集，利用R软件中的“venn”包绘制韦恩图。

1.3 中药-成分-基因网络图绘制

将丹蛭降糖胶囊有效成分与交集基因导入Cytoscape 3.8.0构建“中药-成分-基因“网络图，以展示其交互作用关系。

1.4 丹蛭降糖胶囊成分-DKD靶点PPI网络构建

利用STRING在线软件（http://string-db.org）导入交集靶点信息，选取置信度 > 0.4的数据构建PPI网络，利用Cytoscape 3.8.0软件的CytoNCA插件根据中心度值（betweenness centrality，BC）、紧密中心度值（closenesscentrality，CC）、节点连接度值（degree centrality，DC）、特征向量中心度值（eigenvectorcentrality，EC）、基于局部均值量法中心性（localaverage connectivity，LAC）和网络中心度值（network centrality，NC）的中位值对该网络进行拓扑分析筛选出丹蛭降糖胶囊的核心靶点。

1.5 交集靶点的基因本体（GO）功能富集和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集

将交集靶点导入DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）进行GO功能与KEGG通路富集分析，按照PValue值由小到大进行排序，选择GO功能显著富集的前10项及前20条KEGG通路利用微生信在线平台进行可视化分析。根据KEGG富集结果选取其中1条通路运用R软件绘制作用机制图。

2 细胞实验 2.1 材料 2.1.1 药物

丹蛭降糖胶囊，0.4 g/粒，购于安徽中医药大学第一附属医院制剂中心，专利号：ZL2003101 12845.1，批准文号：皖药制字Z20090006，生产批号：20220823。

2.1.2 细胞

肾小管上皮细胞（HK-2 CL-0109）由武汉普诺赛生命科技有限公司提供。

2.1.3 实验动物

8周龄SPF级SD大鼠6只，购于南京市江宁区青龙山动物繁殖场，动物许可证号：SCXK（浙）2019-0002。动物伦理批号：AHUCM-rats-2021133。

2.1.4 主要试剂

MEM培养基（Precells公司，货号：CM-0109）、CCK-8试剂盒（思科捷，货号：CT0001-A）、IL-1 βELISA试剂盒（江莱生物，货号：JL13662），IL-6 ELISA试剂盒（江莱生物，货号：JL14113），TNF-α ELISA试剂盒（江莱生物，货号：JL10208），anti-Akt（正能生物，货号：R23412）、anti-PI3K（正能生物，货号：R22768）、anti-p-PI3K（正能生物，货号：310164）、anti-p-Akt（正能生物，货号：310021）、GAPDH（正能生物，货号：380626），羊抗兔二抗（Searcare，货号：5220-0336）。

2.1.5 主要仪器

电泳仪（CAVOY，型号：PP-1105），垂直电泳槽（CAVOY，型号：MP-3030），酶标仪（Diatek公司，型号：DR-200Bs），冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号：TGL-16），台式离心机（上海安亭科学仪器厂，型号：TGL-16c），化学发光仪（上海培清科技有限公司，型号：JS-1070P）。

2.2 含药血清制备

根据血清药理学方法^[9]确定药物给药剂量，大鼠的临床等效剂量为人的7倍，故每日按0.74 g/kg给予丹蛭降糖胶囊，6只SD大鼠每日灌胃1次，连续灌胃给药7 d。于末次给药1 h后，予1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，室温静置1 h，以3 000 r/min离心15 min，取上层血清，56 ℃条件下灭活30 min，0.22 μm无菌滤膜过滤，无菌Ep管分装，-80 ℃冰箱保存备用。

2.3 细胞培养

将HK-2接种于培养皿中加入含10%胎牛血清的MEM细胞培养基，培养箱（5%CO₂、37 ℃）中培养至细胞密度达80%，用0.25%胰蛋白酶消化，加入完全培养基终止消化后，1 200 r/min，离心5 min，按1∶2或1∶3进行传代。采用第2~4代处于对数生长期的细胞，按2×10⁵个/mL密接种在96孔板中或6孔板中，进行后续实验。

2.4 CCK8法筛选丹蛭降糖胶囊含药血清对HK-2最佳浓度范围

HK-2按每孔100 μL种于96孔板中，分为6组：空白组，梯度丹蛭降糖胶囊含药血清组5组，每组设3个重复，培养24 h待细胞贴壁后，弃去除培养液，空白组加入常规培养基，含药血清组分别加入含0%、5%、10%、15%、20%丹蛭降糖胶囊含药血清的培养基，每孔100 μL。于24、48、72 h时吸弃原培养基，每孔加入10 μl CCK-8溶液继续孵育1 h，读取酶标仪450 nm处的吸收度（OD）值，并计算细胞增殖抑制率。

2.5 细胞分组与干预

以2×10⁵/mL的密度将HK-2细胞接种于6孔板中，分为对照组、模型组、不同浓度丹蛭降糖胶囊含药血清组（5%、10%），分别于低糖培养基（5.5 mmol/L葡萄糖）、高糖培养基（30 mmol/L葡萄糖）、5%丹蛭降糖胶囊含药血清+高糖培养基（30 mmol/L葡萄糖）、10%丹蛭降糖胶囊含药血清+高糖培养基（30 mmol/L葡萄糖）干预24 h。

2.6 ELISA检测炎症因子水平

药物干预24 h后，收集细胞培养物上清，1 000 r/min，离心20 min，吸取上清液，ELISA试剂盒检测IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，操作步骤严格按照说明书进行。

2.7 免疫印迹法（Western blot）检测PI3K/Akt通路相关蛋白表达

提取各组细胞总蛋白，加入250 μL RIPA裂解液，吹打混匀，冰上孵育10min后移入Ep管，14 000 r/min，4 ℃离心机离心5 min，取上清液移至新的Ep管中按体积比4∶1加入5×上样缓冲液，100 ℃煮10 min，置于-20 ℃冰箱保存备用。取蛋白样本进行电泳、转膜、封闭，分别按说明书予一抗GAPDH（1∶10 000）、PI3K（1∶1 000）、p-PI3K（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）在4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3次，二抗室温下孵育1 h，ECL显色上机，Image J分析图像灰度值。

2.8 统计学方法

采用Graphpad prism8.0.2进行数据统计分析，符合正态分布的结果以均数±标准差（x ± s）表示。差异性比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 丹蛭降糖胶囊有效成分筛选及作用靶点预测

筛选得出丹蛭降糖胶囊有效成分共66种，其中牡丹皮11种、太子参8种、菟丝子11种、泽泻10种、生地黄15种、水蛭11种，有效成分对应的靶点去除重复后为368个。

3.2 DKD疾病靶点获取

将GeneCards、OMIM、DrugBank、TTD数据库中获得的靶点取并集去除重复后得到418个靶点。见图 1。利用R语言中的“venn”包将丹蛭降糖胶囊有效成分对应的靶点与DKD的靶点取交集，最终得到丹蛭降糖胶囊治疗DKD的潜在靶点54个。见图 2。

3.3 中药-成分-靶点-疾病网络图

通过Cytoscape 3.8.0构建丹蛭降糖胶囊-成分-靶点-疾病网络图，见图 3。

3.4 丹蛭降糖胶囊成分-DKD靶点PPI网络构建

将54个交集基因上传STRING在线平台构建PPI网络图并得到TSV格式，共有53个节点，530条边，见图 4。将TSV格式导入Cytoscape 3.8.0软件，利用CytoNCA插件对网络节点拓扑分析筛选核心靶点，筛选标准：BC＞15.22 and CC＞0.60 and DC＞19.00 and EC＞0.12 and LAC＞14.0 and NC＞15.67，筛选到丹蛭降糖胶囊治疗DKD的19个核心靶点。分别为IL-6、TP53、IL-1β、AKT1、MMP9、CCL2、TNF等，这些核心靶点间的互相作用很可能是丹蛭降糖胶囊作用于DKD的关键途径。见图 5。

3.5 GO功能和KEGG通路富集分析

将交集基因导入DAVID数据库，进行GO和KEGG富集分析，得到365个生物学过程（biological process，BP），涉及基因表达的正向调控（positive regulation of gene expression）、RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控（positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱpromoter）、信号转导（signal transduction）、凋亡过程负向调控（negative regulation of apoptotic process）等；35个细胞组成（cellular component，CC），涉及等离子体膜（plasma membrane）、细胞外间隙（extracellular space）、细胞质（cytoplasm）、胞外区（extracellular region）、细胞外外泌体（extracellular exosome）等；63个分子功能（molecular function，MF），涉及相同的蛋白质结合（identical protein binding）、蛋白质同源二聚化活性（protein homodimerization activity）、ATP结合（ATP binding）、锌离子结合（zinc ion binding）、酶结合（enzyme binding）等。119条KEGG信号通路，主要涉及AGE-RAGE信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、MAPK信号通路等，见图 7。PI3K/Akt信号通路，见图 8。

3.6 丹蛭降糖胶囊含药血清对HK-2细胞活性的影响

分别采用0%、5%、10%、15%、20%的含药血清处理24、48和72 h，结果发现干预24后，5%浓度的含药血清表现出促增殖作用（P＜0.05），10%浓度的含药血清表现出促增殖作用，但差异无统计学意义（P＞0.05）；干预72 h后，20%浓度的含药血清表现出细胞毒性（P＜0.05），抑制了细胞活性，后续实验采用5%、10%浓度的含药血清干预24 h。见图 9。

3.7 丹蛭降糖胶囊含药血清对炎症因子

与空白组相比，模型组IL-1β、IL-6、TNF-α水平明显升高（P＜0.01），与模型组相比，5%及10%丹蛭降糖胶囊含药血清组IL-1β、IL-6、TNF-α水平明显降低（P＜0.01）。见表 1。

3.8 丹蛭降糖胶囊含药血清对PI3K/Akt通路相关蛋白的影响

模型组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt的表达明显高于空白组（P＜0.01），丹蛭降糖胶囊含药血清能显著降低p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的表达，差异均有显著性意义（P < 0.01）。见图 10。

4 讨论

DKD是糖尿病患者最常见的并发症之一，也是糖尿病死亡的主要原因之一^[10]。因此，关于DKD深入的分子机制仍然是研究热点，寻找有效的治疗药物对防治DKD意义重大。中医药以其多成分、多靶点、多通路、毒副作用低且药效良好的特点，在DKD的防治中发挥了重要作用。丹蛭降糖胶囊由太子参、生地黄、菟丝子、牡丹皮、水蛭、泽泻组成，方中太子参补脾肾之气，生地黄滋脾肾之阴，菟丝子补肾固精，牡丹皮、水蛭行气活血，化瘀通络，使肾络通畅，泽泻清热去痰浊，全方共奏益气养阴、活血化瘀之功，以期达到阴阳平、瘀阻除、肾脉通之功效。现代研究发现，牡丹皮多糖组分可调节DKD大鼠氧化应激水平和炎症因子表达，通过抑制大鼠肾小球系膜增生、基底膜增厚、炎性细胞浸润等发挥肾脏保护作用^[11]。水蛭及其有效成分具有调节代谢紊乱^[12]、保护足细胞^[13]、减少炎症反应^[14]等作用。太子参具有抗炎抗氧化，增强免疫功能，降血脂，降血糖，保护肾脏的作用^[15]。泽泻多糖作可减轻胰岛素抵抗水平，调节血脂代谢紊乱，改善胰岛素抵抗状态^[16]。生地黄有效成分可以减少糖基化终末产物对肾小球系膜细胞及基质诱导刺激作用^[17]。菟丝子乙醇提取物可显著改善肾阳虚大鼠模型的免疫指标^[18]。

PPI网络分析得出IL-1β、IL-6、TNF、VEGFA等靶点在丹蛭降糖胶囊作用于DKD的生物进程中可能起关键作用。既往研究表明，炎症反应在DKD的发生发展中有着重要作用，在肾损伤早期，IL-1β能够通过促进内皮细胞ICM-1表达等方式召集炎症细胞进入肾间质^[19]。在进展期尿IL-6水平高于非进展期，随着DKD严重程度的增加循环中IL-6水平随之升高^[20]。TNF具有促炎和免疫调节作用，TNF家族的主要表达蛋白TNF-α可刺激单核细胞和巨噬细胞聚集，导致ROS产生，血管通透性增加，进一步损害肾小球^[21]。本研究通过高糖诱导HK-2建立细胞损伤模型，发现与空白组相比，模型组中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著上调（P＜0.01），经丹蛭降糖胶囊干预后IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著降低（P＜0.01）。在DKD早期，VEGFA在足细胞中表达水平升高，DKD晚期时足细胞凋亡，VEGFA表达水平下降，抑制足细胞中VEGFA的表达可改善蛋白尿，但由于VEGFA能保护微血管，完全抑制VEGFA表达，则会加重肾小球损害^[22-23]。

KEGG富集分析结果得到丹蛭降糖胶囊治疗DKD涉及124条通路，包括AGE-RAGE信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、MAPK信号通路等。PI3K/Akt信号通路是调控自噬的重要通路^[24]，参与调控细胞的生长、增殖、凋亡、分化^[25]。PI3K/ Akt信号通路激活可降低自噬水平，研究表明在DKD进程中，抑制PI3K/ Akt通路激活可促进自噬，不仅能够改善肾脏足细胞表型、减轻足细胞损伤，还能在一定程度上抑制系膜细胞增生^[26]。本研究结果表明，高糖可诱导细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达升高，推测PI3K/Akt通路可能被激活，自噬被抑制，高糖条件造成的肾小球上皮细胞损伤与PI3K/Akt通路活化有关，丹蛭降糖胶囊可拮抗由高糖导致的PI3K/Akt通路激活，促进自噬的发生，表明丹蛭降糖胶囊可能通过抑制PI3K/Akt的激活发挥保护HK-2细胞的作用。

长期高血糖状态导致的肾脏血流动力学紊乱及代谢失调可导致炎性细胞浸润和炎症介质水平上升，形成慢性炎症环境^[27]，炎症又可加速DKD进一步发展，加重肾脏损伤，形成恶性循环。PI3K/Ak信号通路广泛存在于细胞内，参与调控细胞增殖、分化、自噬、凋亡等作用^[28]，其激活可抑制自噬。自噬与炎症因子调控呈负向关系，自噬可调节促炎因子的分泌来调节炎症体的组成和激活，从而减少炎症的发生，减弱肾脏损伤，达到保护肾脏的目的^[29]。本研究发现IL-1β、IL-6、TNF-α是丹蛭降糖胶作用于DKD的重要靶点，PI3K/Ak信号通路为核心通路，丹蛭降糖胶囊既能减少炎症因子的释放，又可抑制PI3K/Ak信号通路的激活，充分体现了丹蛭降糖胶囊的肾脏保护机制不是独立，而是交叉存在的，能从多个角度发挥作用。

综上所述，网络药理学预测丹蛭降糖胶囊干预DKD的主要成分具有一定科学性，丹蛭降糖胶囊通过多靶点、多生物学功能、多通路发挥肾脏保护作用，同时细胞实验也证明PI3K/Akt可能为丹蛭降糖胶囊治疗DKD的关键通路。