自身免疫性甲状腺炎（AIT）是一种典型的自身免疫性甲状腺疾病。临床上的AIT病人主要症状有甲状腺功能减退、甲状腺肿和甲状腺纤维化^[1]。AIT有5种类型，分别为桥本甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎、无痛性甲状腺炎、甲状腺功能正常的甲状腺炎和桥本甲亢，其中桥本甲状腺炎（HT）临床上最常见的一类甲状腺炎，约占22.5%^[2]。近年来，HT的发病率不断上升^[3]。其发病机制复杂，目前尚未完全阐明，部分研究提示炎症、免疫失调以及氧化损伤可能是AIT的重要发病机制^[4-6]。其临床治疗药物，包括糖皮质激素、左旋甲状腺素、雷公藤多苷片等对部分患者有一定疗效，但它们诸多的不良反应和断药易复发是不容忽视的缺点^[7]。

异甘草素是豆科植物甘草的主要活性成分之一，研究表明其具有广谱的生物活性，其主要包括抗炎、抗氧化、免疫调节等生物学效应^[8-10]。基于异甘草素的药理作用与AIT的发病机制有部分重合，以及目前异甘草素对AIT的实验研究尚未见报道，因此本实验将通过皮下注射高碘水和猪甲状腺球蛋白混合液建立AIT小鼠模型，探讨异甘草素抗AIT作用。

1 材料 1.1 动物

广东省医学实验动物中心购买60只SPF级、雄性的C57BL/6J小鼠，挑选体质量：18~22 g，动物合格证号：SCXK（粤）2019-0002，实验经广东医科大学动物实验伦理委员会批准，批准号：GDMU-2022-000247。

1.2 药品与试剂

异甘草素：纯度≥98%，批号：062541，购买于南京景竹生物科技有限公司；碘化钠：批号：20210315，购买于上海源叶生物科技有限公司；完全弗氏佐剂：批号：251223，购买于武汉易泰科技有限公司上海分公司；不完全弗氏佐剂，批号：415214，购买于武汉易泰科技有限公司上海分公司；猪甲状腺球蛋白（PTg）：批号：652917，购买于武汉易泰科技有限公司上海分公司；雷公藤多苷片：规格：10 mg×100片，批号：20210617，购买于贵州汉方药业有限公司；小鼠甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）化学发光试剂盒：批号：Y26587405，购买于北京雅安达生物技术有限公司；小鼠甲状腺球蛋白抗体（TGAb）化学发光试剂盒：批号：Y59856514，购买于北京雅安达生物技术有限公司；白介素8（IL-8）ELISA检测试剂盒：批号：12587514，购买于武汉博士德生物工程有限公司；白介素6（IL-6）ELISA检测试剂盒：批号：58782157，购买于武汉博士德生物工程有限公司；白介素23（IL-23）ELISA检测试剂盒：批号：23524558，购买于武汉博士德生物工程有限公司；NLRP3单克隆抗体：批号：X52658715，购买于Abcam公司；Caspase-1单克隆抗体：批号：X12587498，购买于Abcam公司。

1.3 主要仪器

DR-3518酶标分析仪购买于山东莱恩德智能科技有限公司；DM2500光学显微镜购买于奥林巴斯。RM2235型轮转切片机：徕卡显微系统（上海）贸易有限公司；ZF-368全自动凝胶成像分析系统：广州沪瑞明仪器有限公司；荧光ZEISS共聚焦显微镜购买于北京瑞科中仪科技有限公司；DYY-6D电泳仪购买于北京六一生物科技有限公司。

2 方法 2.1 AIT模型建立

小鼠AIT模型的构建主要参照李泽垄等^[11]方法，具体方法为将PTg和完全弗氏佐剂以1∶1配成浓度为0.25 mg/mL的油包水乳剂。皮下多点注射上述乳剂，给药剂量和频次分别为50 μg/只和1次/周，共2周。配制PTg和不完全弗氏佐剂乳化的浓度为0.25 mg/mL的油包水乳剂，并从第3周开始注射，给药方法同上，共注射3周。同时小鼠每日自由饮用浓度为0.63 mg/mL的高碘水。

2.2 分组与给药

本实验共设置6组，分别为空白对照组，模型组、雷公藤多苷片组，异甘草素低中高剂量组，每组10只。造模当天给药，给药组分别灌胃给予雷公藤多苷片5 mg/（kg·d），异甘草素50 mg/（kg·d）、100 mg/（kg·d）、200 mg/（kg·d），空白对照组和模型组灌胃等量生理盐水，共给药3周。

2.3 检测指标

实验结束后，异氟烷麻醉小鼠后，摘眼球取血，离心条件：3 000 r/min，离心半径87 mm，分离血清。利用ELISA检测试剂盒检测各组小鼠血清中TPOAb、TGAb、IL-8、IL-6和IL-23水平。分离各组小鼠甲状腺组织，于10%中性甲醛溶液浸泡24 h，分别于70%、95%和100%酒精中梯度脱水3 h，石蜡包埋后，切片，厚度为5 μm，按试剂盒方法进行组织切片HE染色。

将各组甲状腺组织切片分别浸泡二甲苯2次，每次10 min，随后分别浸泡于100%、95%、70%的乙醇以及纯化水中10 min进行梯度水化。将组织切片浸泡于含EDTA抗原修复液（pH9.0）的高压锅中10 min进行抗原修复，PBS洗3次，5 min/次，使用0.5% TritonX-100溶液浸泡30 min，随后PBS洗3次，5 min/次，使用2% BSA溶液浸泡30 min，不洗，于4 ℃冰箱孵育NLRP3和Caspase-1一抗过夜，PBS洗3次，5 min/次，接着常温孵育荧光二抗1 h，PBS洗3次，每次5 min/次，使用DAPI溶液孵育5 min，PBS洗3次，5 min/次，使用荧光显微镜下拍照，image J软件分析图片荧光强度。

配制合适浓度的SDS-PAGE分离胶-浓缩胶。每孔加入10 uL甲状腺组织样品（总蛋白浓度50 μg）和5 μL彩色预染蛋白Marker，120 V恒压跑胶。甲醇浸泡PVDF膜5 min后，110 V恒压转模120 min。使用5%脱脂奶粉室温封闭PVDF膜2 h。TBST摇床晃动洗膜5次，10 min/次。随后将膜用NLRP3和Caspase-1一抗于4 ℃冰箱中孵育过夜，TBST洗膜5次，10 min/次，接着室温继续孵育二抗1 h。TBST洗膜5次，10 min/次。将PVDF膜滴上显影液后放入成像仪器中曝光并拍照，保存蛋白电泳条带图。使用Image J软件，分析其相对蛋白表达量。

3 统计学方法

实验数据选用SPSS 16.0软件及GraphPad Prism 7.0整理分析。计量资料数据以均数±标准差（x ± s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05认为差异有统计学意义。

4 结果 4.1 异甘草素对各组小鼠甲状腺组织病理学变化的影响

如图 1所示，空白对照组小鼠甲状腺组织中腺泡比较规则，呈立方状，间质厚度均匀，胶质饱满，无明显的炎症细胞浸润。而模型组小鼠的甲状腺结构明显紊乱，不规则滤泡多见，胶质明显减少，滤泡间隔明显增厚，炎症细胞浸润明显。给药后改善效果明显，可见雷公藤多苷片组和异甘草素给药组甲状腺滤泡间隔明显变薄，胶质明显增多，炎症细胞浸润明显减轻，异甘草素呈剂量依赖性地改善上述症状。

4.2 异甘草素对各组小鼠血清TGAb和TPOAb水平的影响

如表 1所示，相对于假手术组，模型组小鼠血清TGAb和TPOAb水平显著上调（P < 0.01）。而相对于模型组，其他给药组小鼠血清TGAb和TPOAb水平显著下调（P < 0.01）。其中异甘草素给药组下调TGAb和TPOAb水平呈剂量依赖性。

4.3 异甘草素对各组小鼠血清IL-8、IL-6和IL-23水平的影响

如表 2所示，相对于空白对照组，模型组小鼠血清IL-8、IL-6和IL-23水平显著上调（P < 0.01）。相对于模型组，其他给药组小鼠血清IL-8、IL-6和IL-23水平显著下调（P < 0.05）。其中异甘草素给药组下调TGAb和TPOAb水平呈剂量依赖性。

4.4 异甘草素对各组小鼠甲状腺组织NLRP3和Caspase-1蛋白表达的影响

相对于空白对照组，模型组小鼠甲状腺组织NLRP3和Caspase-1蛋白表达水平显著上调（P < 0.01）。相对于模型组，其他给药组小鼠甲状腺组织NLRP3和Caspase-1蛋白表达水平显著下调（P < 0.01）。图见开放科学（资源服务）标识码（OSID）。

4.5 异甘草素对各组小鼠甲状腺组织NLRP3和Caspase-1蛋白的表达水平的影响

如图 2所示，相对于空白对照组，模型组小鼠甲状腺组织NLRP3和Caspase-1蛋白的相对表达水平显著上调（P < 0.01）。相对于模型组，其他给药组小鼠甲状腺组织NLRP3和Caspase-1蛋白相对表达水平显著下调（P < 0.05）。其中异甘草素给药组下调NLRP3和Caspase-1蛋白相对表达水平呈剂量依赖性。

5 讨论

AIT是一种临床上常见的器官特异性免疫疾病。虽然目前用于建立AIT动物模型有多种方法，例如脾细胞体外活化移植诱导法、cDNA疫苗免疫法、高碘联合Tg法以及高碘诱发法等^[12]，但以高碘联合Tg的造模方法最为常用，是建立AIT小鼠模型最为理想的方法^[13]，而AIT动物模型的病理特点是甲状腺内淋巴细胞广泛浸润。雷公藤多苷对AIT药效确切，早已有研究证实^[14]，此外，其商品化药物雷公藤多苷片具有祛风解毒、除湿消肿和舒经通络的作用，用于治疗类风湿性关节炎、肾病综合征和系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病，研究表明其药理作用包括抗炎、免疫调节以及抗氧化损伤等^[15]。故本研究选取雷公藤多苷片作为阳性对照药，探讨异甘草素抗AIT效果。

异甘草素是豆科植物甘草的主要活性成分之一，研究表明其具有抗炎、抗氧化、免疫调节等广谱的生物活性^[8-10]。NLRP3/Caspase-1信号通路与AIT的关系是近年来研究的热点，由NLRP3、ASC和Caspase-1所组成的NLRP3炎性体与先天性免疫密切相关^[16]，其可通过激活Caspase-1，从而将IL-1β等前体炎症因子加工成具有活性炎症因子^[17]。GUO等^[18]研究表明增强的NLRP3在AIM2介导的甲状腺滤泡细胞的甲状腺功能亢进以及细胞因子分泌均与AIT密切相关。此外，JIANG等^[19]研究显示免疫细胞通过NLRP3/Caspase-1炎性体途径参与了先天免疫应答。本研究发现模型组小鼠甲状腺结构紊乱，滤泡不规则明显，胶质明显减少，滤泡间隔明显增厚，可见大量的炎症细胞浸润其中。与李泽垄等^[11]研究一致，初步认为AIT小鼠模型构建成功。异甘草素呈浓度依赖性地减轻甲状腺病理学损伤，还可下调血清TGAb和TPOAb水平。而异甘草素高剂量组的改善效果与雷公藤多苷片组相似。

近年来，IL-23已被证实参与了AIT发生发展进程，IL-23主要通过促进Th17细胞的增殖以及分化，活化的Th17细胞进一步分泌大量的IL-17，进一步促进AIT的炎症反应以及免疫损伤^[20]。此外，IL-23与IL-17还形成了一条特殊的炎性轴，进一步激活多条炎症相关信号通路，诱导IL-6和IL-8等多种炎症因子的释放，其在AIT进程发挥关键作用^[21]。本研究结果显示异甘草素呈浓度依赖性地下调血清IL-6、IL-8和IL-23水平。而异甘草素高剂量组下调血清IL-6、IL-8和IL-23水平与雷公藤多苷片组相似。

异甘草素可能通过调控NLRP3/Caspase-1信号通路以及抑制炎症，从而改善AIT小鼠的甲状腺功能，该研究初步为异甘草素作为抗AIT新药提供部分理论依据。