阿奇霉素(AZM)为大环内酯类抗菌药物，是临床上治疗支原体肺炎常用药物^[1]，抗菌效果显著，具有组织分布广泛、抗菌谱广和半衰期长等特点^[2-3]，但对于难治性支原体肺炎的疗效有限，临床使用中有发热、流感样症状和肌肉疼痛等不良反应报道，若大量或长期使用易产生耐药性的问题^[4]。

血必净注射液(简称XBJ)是由王今达教授基于“菌毒炎并治”及“四正四法”的辨证原理，在血府逐瘀汤处方基础上研制而成的现代中药注射剂^[5]，由赤芍、当归、红花、丹参和川芎5味中药组方而成^[6]，临床上广泛用于重症肺炎、脓毒症和因感染诱发的全身炎症反应综合征等重症疾病的治疗^{[4, 7]}。新型冠状病毒感染疫情期间，XBJ作为三药三方之一，显示出显著的临床疗效^[8]。XBJ含有羟基红花黄色素A(HSYA)、芍药苷(PE)、阿魏酸、木犀草素、丹参素、洋川芎内酯I等成分，其中HSYA与PE在制剂中的含量及其静注后在体内的暴露程度最高^[9-11]。这两种成分具有良好的抗炎作用：HSYA可降低肺炎大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-1β、IL-6 mRNA的表达，显著抑制核内NF-κB p65蛋白表达并阻碍NF-κB p65的核移位，减轻博来霉素所致大鼠急性肺炎症^[12]；可降低脂多糖(LPS)诱导急性肺损伤小鼠肺组织TLR4、TNF-α、IL-1β及IL-6 mRNA和蛋白的表达，减轻炎症反应，改善急性肺损伤小鼠肺功能的损伤^[13]；PE可抑制肺组织αvβ3/TGF-β1通路的激活，减少促炎细胞因子的产生和肺胶原沉积，改善甲型流感病毒诱导的小鼠急性肺损伤^[14]。

近年来中西药联合被广泛采纳。中药注射剂具有见效快、安全性好等优点^[15]，常与化学药物联合使用，以达到增效减毒的目的^[16]。例如中药制剂喜炎平注射液、麻杏石甘汤和热毒宁注射液与AZM联合用于小儿支原体肺炎治疗，疗效较单独给药组相比有所增加，且不良反应发生率有所降低^[17-19]。与之类似的临床研究发现，将AZM与中药XBJ联合用于支原体肺炎治疗时，疗效更为显著^[20]；1项140例支原体肺炎患者的观察发现，AZM联合XBJ组疗效明显优于单独使用AZM组^[21]。因此，笔者推测XBJ与AZM联用后，在血浆、组织或者细胞层面可能发生潜在的药动学相互作用，使药物体内/细胞暴露水平增高，进而产生药效增效的效果。

研究采用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)法测定XBJ与AZM单用/联用后，AZM、HSYA、PE在急性肺炎小鼠血浆、肺组织、RAW264.7细胞内的药物浓度，判断两药联用是否存在药动学相互作用，以期为临床安全合理用药提供依据。

1 材料与仪器 1.1 仪器

AB QTRAP5500三重四极杆质谱(美国AB公司)，Acquity UPLC超高液相色谱(美国Waters公司)，AG22331真空浓缩仪(德国Eppendorf公司)，JXFSTPRP-24全自动样品快速研磨仪(上海净信有限公司)，P-150904非接触式细胞破碎仪(比利时Diagenode公司)，Flex Station 3多功能酶标仪(Molecular Devices)，5427R低温超速离心机(德国Eppendorf公司，离心半径25 cm)。

1.2 试剂

XBJ(国药准字：Z20040033)购于天津红日药业有限公司；注射用AZM(国药准字：J20140073)购于美国辉瑞制药有限公司；标准品罗红霉素、HSYA、AZM和氯霉素均购于中国药品生物制品检定研究院；标准品PE购于北京索莱宝科技有限公司；乙腈和甲醇购于美国Fisher公司；甲酸购于ROE公司；培养基(高糖)(DMEM)和胎牛血清(FBS)均购于美国Gibco公司；脂多糖和双抗(青链霉素)购于美国Sigma公司；NF-κBp65(D14E12)XP Rabbit mAb购于美国CST公司；山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluo@555)购于英国Abcam公司。

1.3 动物

360只SPF级ICR雄性小鼠，体质量22~25 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验伦理审查批准号：TJAB-TJU20160032。饲养于温度23~27 ℃、湿度45%~65%、12 h光/暗循环条件下，适应性喂养7 d后开始实验。

1.4 细胞

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

2 方法与结果 2.1 动物肺炎模型及给药方案

成人日用AZM剂量为500 mg，XBJ日用剂量为50 mL，根据体表面积法，20 g小鼠对应70 kg成人的换算系数为0.002 6，折算成小鼠AZM剂量为65 mg/kg，XBJ剂量为6.5 mL/kg^[22]。实验分为AZM单用组(65 mg/kg)、XBJ单用组(6.5 mL/kg)以及AZM+XBJ联合给药组(同等剂量的AZM和XBJ同时给药)。随机分组，每组120只小鼠。实验开始前12 h，所有组别小鼠禁食不禁水，小鼠麻醉后，通过气管滴注50 μL 1 mg/mL的LPS建立急性肺炎小鼠模型。

造模12 h后，各组120只小鼠分别尾静脉注射给药，每只小鼠随机对应于给药后的0、0.167、0.25、0.5、1、2、4、6、12、24、48、96、192 h中的某1个采血时间点，每个时间点10只小鼠，眼眶取血。全血置于含有肝素钠的EP管中，8 000 r/min离心10 min，取血浆作为待测血浆样品。每只小鼠取血后立即脱颈处死取出肺组织称质量，取肺组织作为待测组织样品。

2.2 细胞培养及药物处理

RAW264.7细胞用含10%FBS和5%双抗的DMEM培养基于37 ℃、5% CO₂的培养箱中培养，待细胞融合度约80%-90%时，进行传代或用于实验。实验分为7组，分别为AZM组(2 μg/mL)、XBJ组(稀释50、100和200倍)以及AZM+XBJ联合给药组(同等浓度的AZM和XBJ同时给药)。每组细胞中加入10 μg/mL LPS孵育30 min，建立炎性细胞模型。分别于给药后的0、0.25、0.5、1、2、3、6 h不同时间点，收集细胞并破碎，蛋白含量测定后，将其保存在-80 ℃下，作为待测细胞样品。

2.3 超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC-MS)条件 2.3.1 色谱条件

Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，以0.1%甲酸-水为流动相A，以0.1%甲酸-乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流速0.3 mL/min，柱温40℃，进样体积2 μL。AZM洗脱的条件为：0.00~1.00 min，5%(B)；1.00~1.01 min，5%~40%(B)；1.01~1.70 min，40%(B)；1.70~2.00 min，40%~95%(B)；2.00~2.30 min，95%(B)；2.30~2.31 min，95%~5%(B)；2.31~4.00 min，5%(B)。XBJ的洗脱条件为：0.00~4.00 min，5%~95%(B)；4.00~5.00 min，95%~5%(B)。

2.3.2 质谱条件

采用电喷雾离子化电离源(ESI)，扫描方式为多反应监测(MRM)，检测AZM时采用正离子模式扫描，喷雾电压为5.5 kV，离子化温度为600 ℃，气帘气为30 psi，GS1为55 psi，GS2为50 psi；检测XBJ时采用负离子模式检测，喷雾电压为4.5 kV，离子化温度为550 ℃，气帘气为40 psi，GS1为55 psi，GS2：60 psi。

2.4 溶液配制

精密称取AZM、HSYA、PE对照品适量，分别加入甲醇配制成1 mg/mL的储备液。精密称取罗红霉素、氯霉素对照品适量，分别加入甲醇配制为1 mg/mL的储备液，稀释后得500 ng/mL的罗红霉素、氯霉素的内标溶液。

2.5 生物样本预处理方法 2.5.1 血浆样本

取50 μL血浆，依次加入50 μL罗红霉素内标溶液、氯霉素内标溶液，加入50 μL乙腈-水(3:2，V/V)溶液，涡旋混匀后加入350 μL甲醇，涡旋5 min，以14 000 r/min离心10 min，取上清液，进样分析。在进行AZM测定前，需要对血浆样品进行10倍的稀释处理；对于HSYA和PE的测定，则无须对血浆样品进行稀释处理。

2.5.2 肺组织样本

称取适量小鼠肺组织样品置于研磨管中，按照肺组织质量: 甲醇=1:3的比例加入甲醇，研磨。取组织匀浆液，以14 000 r/min离心10 min，取上清液，得肺组织研磨液。取50 μL肺组织研磨液，依次加入50 μL罗红霉素内标溶液、氯霉素内标溶液，加入50 μL乙腈-水(3:2，V/V)溶液，涡旋混匀后加入350 μL甲醇，涡旋5 min，以14 000 r/min离心10 min，取上清液，进样分析。

2.5.3 细胞样本

待测物为AZM的细胞样本前处理：取50 μL细胞悬液，加入50 μL罗红霉素内标溶液、50 μL乙腈-水(3:2，V/V)溶液，涡旋混匀后加入350 μL甲醇，涡旋5 min，以14 000 r/min离心10 min，取上清液，进样分析。

待测物为HSYA和PE的细胞样本前处理：取50 μL细胞悬液，加入50 μL氯霉素内标溶液、50 μL乙腈-水(3:2，V/V)溶液，涡旋混匀后加入350 μL甲醇，涡旋5 min，以14 000 r/min离心10 min，取400 μL上清液置于真空离心浓缩仪，挥干溶剂，残渣加100 μL甲醇复溶，涡旋5 min，以14 000 r/min离心5 min，取上清液，进样分析。

2.6 统计学方法

采用WinNonlin 8.1药动学软件非房室模型拟合各成分的药动学参数，运用GraphPad Prism 8.0软件分析并进行独立样本t检验，显著性差异水平设定为P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，具有统计学意义。

2.7 血浆药动学

取各组血浆样本，按“2.5.1”项下方法处理，测定AZM、HSYA和PE各时间点的血浆药物浓度。

药-时曲线如图 1所示，AZM在药后192 h内仍可被检测到，且AZM+XBJ联用组中AZM的药时曲线下面积大于AZM单独用药，差异具有统计学意义(P < 0.001)；XBJ主要成分HSYA和PE在12 h内均能被检测到，联合用药后HSYA和PE的药时曲线下面积也高于XBJ单独用药，差异具有统计学意义(P < 0.001)。

药代动力学参数见表 1。结果显示，与AZM单用组相比，AZM与XBJ联合使用后，血浆中AZM的t_1/2、C_max与AUC_0-t均升高, 差异具有统计学意义(分别为P < 0.05，P < 0.001)，CL下降，差异具有统计学意义(P < 0.001)。与XBJ单用组相比，联合给药后HSYA与PE在体内的C_max与AUC_0-t提高，差异具有统计学意义(分别为P < 0.05，P < 0.01)，CL下降，差异具有统计学意义(P < 0.001)，但两者的半衰期和平均滞留时间差异无统计学意义(P > 0.05)。

2.8 肺组织分布

取各组肺组织样本，按“2.5.2”项下方法处理后进样，测定AZM、HSYA、PE各时间点的组织药物浓度，采用WinNonlin 8.1软件处理后，使用GraphPad Prism 8.0软件分析并进行独立样本的t检验。结果如图 2所示，联合给药组的AZM、HSYA和PE在肺组织中的含量均高于单独给药组。

2.9 细胞药动学研究

取各组细胞样本，按“2.5.3”项下方法处理后进样，测定AZM、HSYA和PE各时间点的细胞药物浓度，采用WinNonlin 8.1软件处理，计算药动学参数AUC，使用GraphPad Prism 8.0软件分析并进行独立样本的t检验。AZM、HSYA和PE的细胞药物浓度变化如图 3所示，药-时曲线下面积见表 2。给药后AZM、HSYA和PE均可快速被细胞摄取；AZM在2 h达到浓度峰值，AZM细胞内药物浓度和AUC，联合给药组较单独给药组均有所升高，差异具有统计学意义(分别为P < 0.01，P < 0.001)；HSYA和PE的细胞内药物浓度与AUC，联合给药组和单独给药组未发生变化，差异无统计学意义(P > 0.05)。

3 讨论

AZM具有特殊的药代动力学特征(半衰期长，在血液和组织中高浓度聚集)，若能长期维持较高的体内药物浓度，则有望进一步增强其疗效。基于此，实验将XBJ与AZM联合使用，探讨两药合用后中药对西药及西药对中药药物浓度的影响。药动学研究结果显示，AZM与XBJ联用后可显著增加AZM、XBJ中的HSYA和PE在肺炎小鼠体内的t_1/2与在血浆和肺组织中的AUC、T_max，减小AZM、HSYA和PE在血浆中的CL，提示联合用药可延长AZM、HSYA和PE在血浆与肺组织中的滞留时间，减缓其在体内的清除。有临床研究表明，AZM与XBJ联合用于支原体肺炎治疗，合用组较AZM单用组可显著促进炎症消散，明显缩短治愈时间，增加治愈率^[21]。由此笔者推测两药联用后产生的药代动力学变化，可能是AZM增加药物抗炎药效的重要因素。

通常而言，药物发挥药效需要跨越许多生物学屏障，并与细胞内的特定靶标产生相互作用^[23]。因此与血浆药物浓度相比，靶细胞内药物浓度有时可以更好地反映出药效^[24]。RAW264.7细胞药代动力学实验结果显示，AZM与XBJ联合使用后，AZM的细胞药代动力学特征出现显著变化，细胞内药物浓度较单一用药显著增加；而HSYA与PE的细胞药代动力学未发生改变，这可能与AZM独特的药代动力学特征(AZM对细胞的靶向作用较强^[25]，能高效地富集于细胞内，尤其是吞噬细胞^[26])有关。据报道，AZM可通过中和巨噬细胞中溶酶体pH，增加AZM的外排，使其以较高浓度蓄积在细胞内^[27]。笔者推测：炎症状态下，XBJ可促进巨噬细胞摄取AZM，使其富集于溶酶体内，增加AZM在巨噬细胞内的暴露水平，随后再靶向转移分布至感染组织，达到增强抗炎作用的效果。

另一方面，XBJ与AZM联合用药后，有助于改变AZM在血液、组织间液与细胞内液间的分布，增加AZM、HSYA和PE在肺组织的富集，减少AZM向肺外组织的分布，起到减少AZM不良反应(累及多个组织器官)的目的。