衰老是一种正常且复杂的生物学过程，主要指机体的组织结构与生理功能发生进行性衰退^[1]。《素问·上古天真论》云：“女子……五七，阳明脉衰，面始焦……六七，三阳脉衰于上，面皆焦……七七，任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭。”营卫出自中焦，化生于脾胃运化的水谷精微。脾主大络，主营卫的交会气化。张景岳指出：“女为阴体，不足于阳，故其衰也，自阳明始。”从“阳明脉衰”到“三阳脉衰于上”，再到“任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭”，是女性病理生理内环境演变的3个关键环节。“阳明脉衰”，脾胃津气不足，“三阳脉衰”，营卫生成、气化、敷布障碍，肾之精气虚损则“任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭”。围绝经期女性常处于《黄帝内经》所述的“七七”之年，其皮肤功能及状态是衰老的皮肤功能与状态的典型代表^[2]。

临床中围绝经期女性常见证型为肝肾阴虚型，治疗以补益肝肾为主。根据吴鞠通在《温病条辨》中所述：“夜热早凉，热退无汗，热自阴来者，青蒿鳖甲汤主之。”故常选用青蒿鳖甲汤加减治疗围绝经期综合征。周铭心教授认为表现于外的肌肤皮毛病证，多责之于营卫不和，其卫气失常在于合而少开，营气失常责之润养不及，故治疗应当以调营达卫布津为法。“调营达卫布津法”在治疗肌肤皮毛疾病时，多从脏腑论治，尤重辛味，取其能开脏腑之腠理、宣通津液、促津环流之功。其代表药物有当归、熟地黄、生地黄、白芍、玫瑰花、桑椹、牡丹皮等^[3]。研究采用网络药理学和体外实验研究的方法探究青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方改善皮肤衰老的作用机制，预测青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方的活性成分及核心靶点，为青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方改善皮肤衰老提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方改善皮肤衰老网络药理学研究 1.1.1 药物-疾病交集靶点的筛选及蛋白互作（PPI）网络构建

利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http:/old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、DrugBank数据库（https://go.drugbank.com）和相关文献检索方法，获得青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方的化合物成分，以生物口服利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为标准进行筛选。将靶点信息分别输入Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/），限定物种来源为“Human”，查询靶点蛋白的基因名，删除重复和无人类基因名对应的靶点。使用Cytoscape 3.7.2软件构建“药物-成分-靶点”网络图，使用Network Analyzer功能分析其主要活性成分。

1.1.2 皮肤衰老靶点收集

以“skin aging”为检索词进行检索，设定物种为人，分别在TTD（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）、OMIM（https://omim.org/）、Disgenet（https://www.disgenet.org/）、GeneCards（https://www.genecards）、Drugbank（https://www.drugbank.ca）5个数据库获取皮肤衰老相关靶点。

1.1.3 “成分-靶点-疾病”网络

利用Cytoscape 3.7.2进行网络拓扑属性分析，绘制青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方改善皮肤衰老的“成分-靶点-疾病”可视化网络图。利用网络连接度（Degree）、介度（Betweenness）、紧密度（Closenesss）等筛选出青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方改善皮肤衰老的关键靶点。

1.1.4 基因本体（GO）功能富集和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

将筛选出的关键靶点导入Metascape数据库（https://metascape.org/gp/）进行GO功能富集分析，包括生物过程（BP）、细胞组分（CC）及分子功能（MF），并进行KEGG通路富集分析，得到青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方改善皮肤衰老的主要作用通路。

1.2 青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方改善皮肤衰老的细胞实验 1.2.1 药物与试剂

人角质形成细胞（HaCat，批号：0RSTVZ4R2D）、磷酸缓冲盐溶液（PBS，批号：WH0022U091）购自武汉普诺赛公司；胎牛血清（批号：0001654954）、叠氮化合物2，2’-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐（AAPH，批号：MKCR5715）购自美国Sigma公司；基础培养基（DMEM，批号：8123152）、0.25%胰蛋白酶消化液（批号：2492939）购自美国gibco公司；青霉素-链霉素混合液（批号：20220930）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量检测试剂盒（批号：2305001）购自Solarbio公司；细胞增殖及毒性检测（CCK-8）溶液（批号：K10181133EF5E）购自APExBIO公司；蛋白免疫印迹（Western blot）及碘化丙啶（PI）细胞裂解液（批号：050423230522）购自上海碧云天公司；磷酸化蛋白激酶B（p-AKT，批号：4060T）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR，批号：4436T）、P53（批号：2524T）购自CST公司；磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK，批号：DF7576）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ，批号：AF6284）购自AFFINITY公司；β-葡萄糖脑苷脂酶（GCASE，批号：27972-1-AP）、聚丝蛋白（FLG，批号：60325-1-IG）购自武汉三鹰公司；GAPDH（批号：AB-P-R001）购自杭州贤至生物有限公司；牡丹皮（批号：02-22040101）、鳖甲（批号：210801）、知母（批号：01-22090101）、青蒿（批号：220512-1）、玫瑰花（批号：20220901）、生地黄（批号：02-22060101）、桑椹（批号：220704）购自新疆医科大学附属中医院。

1.2.2 青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方改善衰老的HaCat细胞

使用DMEM+15%胎牛血清（FBS）+1%双抗培养HaCat细胞。将细胞培养于37 ℃、5%CO₂培养箱中，当细胞在无菌培养瓶中生长至80%~90%，进行传代，并用于后续实验。使用2 mmol/L的AAPH干预HaCat细胞48 h建立细胞衰老模型^[4]，再用不同浓度的青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方冻干粉溶液干预细胞，确定药物干预浓度及时间，收集干预后的细胞与上清液用于试剂盒测定。

1.3 统计学分析与制图

数据结果分析与制图均采用Graphpad Prism 9.5.1软件。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，满足正态分布和方差齐性的数据，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法；若方差不齐，组间比较采用Tamhane’s T²法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方改善皮肤衰老网络药理学结果 2.1.1 活性成分与作用靶点的网络构建

通过检索和筛选共得到符合标准的活性成分86个，其中青蒿22个、鳖甲20个、生地黄2个、知母15个、牡丹皮11个、玫瑰花10个、桑椹6个。将其活性成分及靶点导入Cytoscape 3.7.2软件进行网络绘制，共得到836个节点、3 519条边，分别代表青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方有效成分与靶点、药物之间的对应关系。其中六边形代表药物有效成分，菱形代表潜在作用靶点，圆形代表共同有效成分，节点分别表示药物、成分和靶点蛋白，边代表 3者之间的对应关系，图形大小与对应关系成正比。该网络图直观地反映了这些成分与靶标的相互作用，见图 1。通过Network Analyzer利用网络连接度（Degree＞60）筛选出青蒿鳖甲汤改善皮肤屏障衰老排名前15位的活性成分，见表 1。

2.1.2 药物与疾病交集基因核心靶点的筛选

采用微生信（https://www.bioinformatics.com.cn/）绘制“药物-皮肤衰老”交集维恩图（Venn图），见图 2。Venn图共筛选出264个药物与疾病的交集基因。将药物-疾病的264个交互靶点导入STRING数据库（https://www.string-db.org/）进行PPI网络分析，获得135个核心蛋白、2 592条相互作用连线。在Cytoscape 3.7.2软件中，利用Degree＞38.4筛选出64个节点、1 542条边，再通过Betweenness＞0.010 148和Closenesss＞0.693 3共筛选出11个节点、55条边，并在Powerpoint中绘制流程图，见图 3。

2.1.3 靶点GO富集和KEGG通路分析

将交集靶点应用Metascape数据库进行GO功能富集分析，得到GO条目49个[P < 0.05，假发现率（FDR） < 0.05]，其中BP条目19个（Enrichment≥100）、CC条目9个（Enrichment ≥50）、MF条目21个（Enrichment≥100）。将得到的数据导入微生信进行可视化，见图 4。BP主要富集在蛋白质和氨基酸的磷酸化、对化学应激和含氧水平变化的反应、脂多糖反应、急性炎症反应、细胞凋亡、细胞内稳态及细胞的增殖和迁移等，CC主要富集在膜筏、膜微区、神经元细胞体及池体等，MF主要富集在生长因子、信号受体及蛋白激酶等。

将交集靶点应用Metascape数据库进行KEGG通路富集分析，筛选得到95条信号通路（P < 0.05，FDR < 0.05）。选取Enrichment≥150的信号通路（共19条）导入微生信进行可视化。KEGG富集通路主要包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、膀胱癌、胰腺癌、结直肠癌、缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路、磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路、子宫内膜癌、丙型肝炎、黑素瘤等，见图 5。

根据KEGG富集分析结果，绘制青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方改善皮肤衰老的主要信号通路图，见图 6。

2.2 青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方改善衰老的HaCat细胞实验 2.2.1 青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方冻干粉的制备

青蒿6 g，鳖甲15 g，知母6 g，牡丹皮9 g，生地黄12 g，桑椹9 g，玫瑰花9 g。每剂饮片常规煎煮2次，煎液合并过滤、混合后分装在50 mL离心管，在低温高速离心机中（3 500 r/min，离心半径15 cm）离心15 min，离心后吸取上清从0.22 μm的针式过滤器中滤过，滤过后的药物放置于蒸发皿中进行旋蒸。将药物浓缩至原浓度的10倍，将浓缩好的药物封口后室温放置待其冷却，随后将药物放置在真空干燥盘中，用保鲜膜封口，将药物放置在-80 ℃冰箱中冷却过夜，第2日将冷冻好的药物放置在真空干燥机中冻干24 h。将冻干完成的药粉放置在超净台上分装至冻存管中，-80 ℃冰箱保存，将制好的冻干粉用DMEM配置成1 mg/mL的完全培养基（母液），保存在-20 ℃冰箱中。

2.2.2 青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方对衰老的HaCat细胞增殖率的影响

将1 mg/mL母液用完全培养基稀释至不同浓度，给予HaCat细胞不同浓度的青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方干预48 h后，利用CCK-8溶液检测细胞增殖率，结果示10、20、40、80 μg/mL的青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方可以提高细胞增殖率。进一步用青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方干预衰老的HaCat细胞，发现与模型组比较，10、20、40 μg/mL的青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方可以明显提高衰老的HaCat细胞增殖率（P＜0.01或P＜0.05），见图 7。

2.2.3 青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方对衰老HaCat细胞中p-AKT、p-mTOR、p-ERK、PPAR-γ、FLG、GCASE蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组的p-mTOR明显升高（P＜0.05），p-AKT、p-ERK显著升高（P＜0.01），PPAR-γ、GCASE显著降低（P＜0.01），FLG明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，中药组的p-AKT、p-mTOR明显降低（P＜0.05），p-ERK显著降低（P＜0.01），PPAR-γ明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，PI3K抑制剂组和ERK抑制剂组的p-AKT明显降低（P＜0.05），p-mTOR、p-ERK显著降低（P＜0.01），PPAR-γ、GCASE、FLG明显升高（P＜0.05），见图 8。

3 讨论与结论

脏腑-皮毛功能轴是皮肤病辨证论治的理论依据。皮毛疏泄与润泽是脏腑-皮毛功能轴作用于皮毛功能和状态方面的反馈，中医皮毛疏泄与润泽的功能状态与西医皮肤屏障功能具有趋同性^[5]。周光等^[6]经过大量文献研究与长期临床经验将中医皮毛的功能和状态概括总结为疏泄与润泽。皮毛之疏泄，是通过皮毛“开”与“阖”的生理状态与功能表现，进行皮毛新陈代谢和疏泄肌表之邪气；皮毛之润泽，包括皮毛的濡润与气血、津液敷布的生理状态与功能表现。围绝经期女性皮肤衰老内因在于“阳明脉衰”至“三阳脉衰”，肝肾阴虚，营卫生成、敷布障碍；外因在于邪气蕴肤，玄府腠理开阖失调，皮肤络脉阻塞，皮毛疏泄与润泽功能状态失衡，皮毛失于濡养。

刘爱玲等^[7]研究发现青蒿鳖甲汤合西北燥证经验用药不仅可以改善肝肾阴虚型围绝经期综合征的中医证候，还可以增加围绝经期大鼠皮肤组织水通道蛋白3（AQP3）及皮肤角质层含水量，改善大鼠皮肤状态。调营达卫布津法多使用具有走肌腠、通络脉、开达卫分、破解燥结及益气和血、调和营气、布施津液功效的药物^[3]。青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方由青蒿、鳖甲、生地黄、知母、牡丹皮、桑椹、玫瑰花7味药物组成。甘润之知母、生地黄、桑椹具有滋阴生津以润燥、助精血津液化生之功；苦辛之青蒿、牡丹皮疏泄皮毛之开阖，敷布精血于皮毛；咸寒之鳖甲、知母能直入阴分，滋肝肾之阴以退热；甘温之玫瑰花能行气活血以通络解郁。全方具有补肝肾、化精血之用，辅以辛药，以辛润之，行气血津液，使补而不滞，达到补益肝肾兼调营达卫布津之功。

网络药理学分析发现，组成青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方的7味中药共含有86种活性成分，在网络中度值较高的活性成分分别为槲皮素、山柰酚、哈巴俄苷、牡丹皮苷H等。槲皮素通过调节核转录因子-κB（NF-κB）抑制炎症相关因子，如肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）等的表达，调控机体炎症反应^[8-9]；通过淬灭自由基，降低氧化应激水平及PI3K活性以促进自噬^[10]；槲皮素能够降低胶原分解，促进胶原与透明质酸合成，防止角质形成细胞凋亡及线粒体损伤，对于维持皮肤弹性、减少皱纹形成、延缓皮肤衰老具有重要意义^[11-12]。山柰酚可以抑制NF-κB和信号传导及转录激活因子3（STAT3）活化，减轻炎症反应，清除活性氧簇，降低氧化应激^[13-14]；通过抑制MAPK、PI3K/AKT信号通路，促进细胞自噬，提高细胞超氧化物歧化酶（SOD）活力，降低丙二醛（MDA）含量，从而有效预防皮肤老化的发生^[15-16]。哈巴俄苷具有增强免疫、抗氧化、抗炎作用^[17-18]。牡丹皮苷H具有抗氧化、抗炎作用^[19]。青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方改善皮肤衰老的核心靶点包括TNF、蛋白激酶B1（AKT1）、IL-6、IL-1β和血管内皮生长因子A（VEGFA），TNF、IL-6和IL-1β是极其重要的促炎介质^[20]。其中，TNF不仅可以启动免疫调节，还可以诱导细胞发生凋亡，从而促进炎症性衰老^[21]。IL-6参与吞噬作用、抗原呈递和炎症调节，在炎症性衰老中发挥关键作用^[22]。IL-1β在T淋巴细胞活化过程中作用显著^[23]。VEGFA是血管生成和维持其通透性的关键调节因子，与血管内皮细胞的增殖、修复有关。AKT1是PI3K/AKT信号通路中重要调控因子之一，在调节代谢、细胞存活和生长等多种生物反应中发挥重要作用^[24]。KEGG信号通路富集分析结果涉及MAPK、HIF-1、PI3K/AKT等信号通路。MAPK信号通路主要包括p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）、细胞外信号调节激酶（ERK）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）。在皮肤老化过程中，活性氧（ROS）的过度产生激活了MAPK和转录因子，如NF-κB、核因子红血球相关因子2（Nrf2）、JNK、氧化还原敏感激活蛋白-1（AP-1）。NF-κB和AP-1均有助于炎症和皱纹形成，导致细胞间基质（ECM）内稳态失调，并在加速皮肤老化过程中发挥重要作用^[25]。PI3K/AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路是调节生长与代谢的关键途径，该信号通路与细胞衰老密切相关。大量的ROS可以激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，活化的AKT可以使细胞内的一系列底物发生磷酸化，进而介导细胞的生长与存活，其中最核心的底物是mTOR，研究发现mTOR的抑制剂雷帕霉素具有抗衰老作用^[26]。PI3K/AKT信号通路与其他信号通路相互影响，表现出交叉抑制、交叉激活、负反馈回路和底物收敛等多种调控方式，共同调控多种细胞功能，其中最重要的是ERK信号通路^[27]。PPAR-γ是PI3K/AKT/mTOR和ERK/mTOR信号通路的下游蛋白，可以促进角质形成细胞分化、表皮皮脂合成、抗炎作用起效及屏障功能改善^[28]。FLG是人体皮肤的晚期分化标志物，在表皮屏障功能中起关键作用。研究表明PPAR-γ激动剂可以增加皮肤中FLG及其他结构蛋白的表达，维持皮肤稳态^[29]。PPAR-γ能够激活GCASE，GCASE是神经酰胺（Cer）合成的关键酶，Cer在角质层形成具有较强缔合水分子能力的网状结构，发挥保水、抑制炎症反应、促进皮肤屏障功能修复的作用^[30]。

细胞实验结果显示，与模型组比较，中药组可以降低p-AKT、p-ERK、p-mTOR表达水平，提高PPAR-γ、FLG、GCASE表达水平。与中药组比较，PI3K抑制剂组及ERK抑制剂组均可以进一步降低p-AKT、p-ERK、p-mTOR表达水平，提高PPAR-γ、FLG、GCASE表达水平。青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方具有与PI3K抑制剂、ERK抑制剂相类似的作用，通过调节PI3K/AKT/mTOR和ERK/mTOR信号通路及其下游相关蛋白发挥改善皮肤屏障功能、延缓皮肤衰老作用。

本研究基于中西医皮毛组织结构同一性，皮毛的疏泄、润泽功能状态与表皮屏障通透功能的趋同性认识，通过补益肝肾及调营达卫布津法影响调控了PI3K/AKT和ERK信号通路及其下游的与皮肤屏障功能相关蛋白，达到延缓皮肤衰老的效果。未来仍然需要进一步从相应的单体化合物着手，进行相关信号通路的实验研究，以期为青蒿鳖甲汤合调营达卫布津方的创新中药新药开发奠定坚实基础。