2型糖尿病（T2DM）又称非胰岛素依赖型糖尿病，是一种以不同程度的胰岛β细胞功能下降、胰岛素抵抗（IR）为特征的慢性疾病^[1]，可以导致多器官损伤和多种并发症，严重降低患者生活质量。目前，中国的T2DM发病率呈明显上涨趋势，约占糖尿病患病人群的90%^[2]。临床治疗T2DM仍以西药为主，如注射胰岛素或口服西药，如双胍类、磺脲类、α-葡萄糖苷酶抑制剂等。中医药诊治技术源远流长，是多年研究与实践的结合，在防治T2DM方面逐渐受到关注^[3]。中医认为T2DM属于“消渴”范畴，中医理论将多味中药配伍组成的中药方剂，如消渴方、玉女煎等用于治疗消渴，这些方剂一直被沿用至今^[4]。且中医药治疗糖尿病历史悠久，理论丰富，可以通过多靶点、多环节、多种途径对T2DM进行防治^[5]。

糖利平胶囊是全国名老中医刘文峰教授根据多年临床经验研制而成的院内制剂，全方由香附、黄连、蚕沙组成，方中香附疏肝解郁、理气宽中、调经止痛，为君药；黄连清热燥湿、泻火解毒，与香附配伍，疏肝泻火、行气清热；蚕沙祛风除湿、和胃化浊、活血通络。诸药合用，共奏疏肝理气、活血化瘀之效^[6]。现代药理学研究显示，香附总黄酮（200 mg/kg）可以显著降低糖尿病大鼠空腹血糖（FBG），升高糖尿病大鼠血清、肝肾匀浆中过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）与超氧化物歧化酶（SOD）含量，表明香附总黄酮对糖尿病大鼠具有一定的治疗作用，且能够有效改善大鼠血脂、血糖及氧化应激水平^[7]；黄连中小檗碱（156 mg/kg）可以显著降低糖尿病大鼠FBG和空腹胰岛素（FINS）水平，表明小檗碱可以改善糖尿病大鼠血糖与IR，发挥治疗T2DM作用^[8]；蚕沙提取物可以改善糖尿病大鼠糖脂代谢异常，从而有益于糖尿病慢性并发症的防治^[9]，表明糖利平胶囊具有降低血糖作用。目前，糖利平胶囊广泛应用于临床治疗T2DM，疗效显著，但缺乏相关的作用机制研究。

网络药理学是一门基于数据挖掘和高通量组学分析的交叉学科，具有系统性、整体性特点，与中医整体观念吻合，可以通过构建“药物-靶点-疾病”相互作用网络，揭示药物作用机制^[10]。分子对接是通过受体和药物分子之间的相互作用来进行药物设计的方法，可以用于验证网络药理学的预测结果^[11]。因此，本研究运用网络药理学方法结合分子对接技术预测糖利平胶囊治疗T2DM的作用机制，并筛选糖利平胶囊治疗T2DM的活性成分与核心靶点。在此基础上，通过体外细胞实验构建IR细胞模型并进行实验验证，以期为糖利平胶囊的后续基础及临床研究提供理论参考。

1 材料 1.1 细胞

人肝癌细胞株HepG2细胞，购于中国科学院细胞库。

1.2 药物与试剂

糖利平胶囊（天津中医药大学第二附属医院，批号：2403001）；二甲双胍（大连美仑生物技术有限公司，批号：1115-70-4，质量分数≥ 99%）；杜氏改良伊格尔培养基（DMEM高糖培养基，美国Gibco公司，批号：8121211）；胎牛血清（美国Gibco公司，批号：10099-141）；细胞计数试剂盒-8（CCK-8）溶液（陶素生化科技有限公司，批号：C0005）；葡萄糖测定试剂盒（北京北化康泰临床试剂有限公司，批号：1017）；胰岛素（Sigma公司，批号：I9278）；兔抗磷酸化蛋白激酶B（p-Akt，Cell Signaling Technology公司，批号：4060T）；兔抗蛋白激酶B（Akt，Cell Signaling Technology公司，批号：4691T）；兔抗磷脂酰肌醇3激酶（PI3K，成都正能生物技术有限责任公司，批号：M05SE03）；兔抗磷酸化PI3K（p-PI3K，成都正能生物技术有限责任公司，批号：M26SE11）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：PC0020）；蛋白磷酸酶抑制剂（北京索莱宝科技有限公司，批号：20211115）；5×蛋白质上样缓冲液（北京索莱宝科技有限公司，批号：20211009）；免封闭聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶快速制备试剂盒[翌圣生物科技（上海）股份有限公司，批号：P9118050]；聚偏二氟乙烯膜（美国Millipore公司，批号：R1MB52547）；电化学发光（ECL）超敏显色试剂盒[翌圣生物科技（上海）股份有限公司，批号：2010082]；辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG，H+L）HRP二抗（美国Affinity Biosciences公司，批号：S0002，）；内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）鼠单克隆抗体（美国CST公司，批号：97166）。

1.3 仪器

Milli-Q型超纯水器（美国Millipore公司）；-80 ℃超低温保存箱（中国海尔公司）；XW-80A型漩涡混合器（上海医科大学仪器厂）；Infinite M200 Pro型多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）；E-Gel Imager凝胶成像仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；CM1900电泳仪（美国Bio-Rad公司）；VE-186湿转电泳槽（上海Tanon科技有限公司）；Heraguard^TM超净工作台（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法 2.1 糖利平胶囊活性成分筛选

利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），分别以香附、黄连、蚕沙为关键词检索其化学成分，并根据药物的ADME参数，以口服生物利用度（OB）≥ 30%且类药性（DL）≥ 0.18作为筛选条件^[12]。同时查阅相关文献，对糖利平胶囊中虽不满足上述筛选条件，但具有明确降血糖药理作用的成分进行补充^[13]，最终得到糖利平胶囊的活性成分。

2.2 糖利平胶囊活性成分作用靶点预测

将糖利平胶囊活性成分在Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取活性成分的简化分子线性输入规范（SMILES）。将糖利平胶囊活性成分的SMILES导入Swiss Target Prediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/），限定物种为“Homo sapiens”，并筛选出“possibility”>0的靶点作为糖利平胶囊活性成分的作用靶点。

2.3 T2DM相关作用靶点获取

通过GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man，https://www.omim.org/）和TTD（Therapeutic Target Database，https://db.idrblab.net/ttd/）数据库，以“type 2 diabetes mellitus”关键词进行检索，并将3个数据库获得的靶点合并后删除重复值，得到T2DM相关作用靶点。

2.4 蛋白相互作用（PPI）网络构建及分析

将糖利平胶囊活性成分的作用靶点与T2DM的疾病作用靶点导入VENN（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在线工具，取其交集，获得共同靶点。通过STRING数据库（https://cn.string-db.org/）对共同靶点进行PPI网络构建，并导出TSV格式文件，将PPI网络的TSV格式文件导入Cytoscape 3.9.1平台进行可视化分析。

2.5 基因本体论（GO）功能富集和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

为进一步挖掘糖利平胶囊治疗T2DM的作用机制，将核心靶点导入DAVID 6.8数据库（https://david.ncifcrf.gov/），使用“Functional Annotation”功能，将物种设置为“Homo sapiens”，进行GO和KEGG通路富集分析，并以P＜0.05作为筛选条件，筛选出糖利平胶囊治疗T2DM的主要生物过程及信号通路，运用微生信平台（http://www.bioinformatics.com.cn）对其结果进行可视化处理。

2.6 分子对接

为进一步探究糖利平胶囊的活性成分与核心靶点的稳定性作用关系，选择糖利平胶囊的活性成分与“2.4”项PPI网络图中Degree值排名靠前的核心靶点运用AutoDock 4.2.6软件进行分子对接操作。首先从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载糖利平胶囊活性成分的SDF格式文件，利用Chem 3D对其进行优化后，导入AutoDockTools 1.5.7软件进行添加原子电荷，设置可旋转键，保存其PDBQT格式，作为对接配体。然后运用蛋白质数据库（PDB，http://www.pdbus.org/）下载核心靶点蛋白的3D结构，再用PyMOL软件对核心靶点蛋白进行去水、删除原配体后，导入AutoDockTools 1.5.7软件对核心靶点蛋白进行加氢、计算电荷后保存，作为蛋白受体。通过查阅相关文献，设置Grid Box格点中心位置坐标，定义盒子大小。最后利用AutoDock软件进行分子对接。

2.7 细胞实验验证 2.7.1 糖利平水提物制备

准确称取糖利平胶囊粉末0.5 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入50 mL纯水，密塞，超声处理60 min，静置30 min，吸取上清液，0.22 μm滤膜滤过，取续滤液旋蒸得到固体粉末，将固体粉末用冻干机干燥并称取质量，使用二甲基亚砜（DMSO）配置成一定浓度的溶液。

2.7.2 细胞培养

将HepG2细胞置于37 ℃、5%二氧化碳（CO₂）恒温培养箱中，采用配制好的完全培养基（高糖DMEM培养基+10%胎牛血清+1%青链霉素）进行常规传代培养。

2.7.3 糖利平胶囊水提物对HepG2细胞活性的影响

取对数生长期的HepG2细胞以4×10³个/孔的密度接种于96孔板中，置于37 ℃、5%CO₂的培养箱中培养24 h，加入不同浓度的糖利平水提物（50、100、200、400、600、800、1 000 μg/mL），每个浓度设置6个复孔，另设空白组（仅含培养基，不接种细胞）和对照组（不加药）。继续置于37 ℃、5%CO₂的培养箱中培养24 h，弃去原培养基，加含10%CCK-8的培养基100 μL，培养箱中孵育1 h，用酶标仪检测各组450 nm波长处的吸光度值，并计算细胞存活率。

2.7.4 IR细胞模型建立

根据参考文献[14]，建立IR细胞模型。取对数生长期的HepG2细胞以2×10⁵个/孔的密度接种于12孔板中，置于37 ℃、5%CO₂的培养箱中培养，待细胞贴壁后，吸弃上清培养基，加入无血清培养基及饥饿培养基12 h，吸弃上清培养基，磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤2次，加入新配置的含有10^-6 mol/L胰岛素的完全培养基培养24 h，24 h后检测模型组和对照组上清中的葡萄糖含量，若模型组葡萄糖含量显著高于对照组，即判定IR细胞模型建立成功。

2.7.5 糖利平胶囊对IR HepG2细胞IR葡萄糖消耗量的影响

取对数生长期的HepG2细胞以4×10³个/孔的密度接种于96孔板中，设为正常组（正常培养基）、IR模型组（含10^-6 mol/L胰岛素的培养基）、糖利平胶囊组（IR细胞模型建立成功后，加入含1.0 mg/mL糖利平的培养基）、二甲双胍组（IR细胞模型建成后，加入含1.0 mmol/mL二甲双胍的培养基），每组设置7个复孔。培养24 h后，收集细胞上清液，用葡萄糖测定试剂盒进行测定。采用萄糖氧化酶法计算各组葡萄糖的消耗量。

2.7.6 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达

取对数生长期的HepG2细胞以4×10⁵个/孔的密度接种于6孔板中，每孔加入2 mL培养基，置于37 ℃、5%CO₂的培养箱中培养24 h。细胞按照“2.7.4”项下分组、造模、给药后，吸弃培养基，用PBS轻缓漂洗2次，收集各实验组细胞，加入新鲜配制的含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，置于冰上进行裂解并匀浆，并用BCA法进行蛋白定量检测。取蛋白样品50 μg，将5×蛋白上样缓冲液与样品以1∶4的比例充分涡旋，密封，煮沸8 min，进行SDS-PAGE电泳，转膜后，用5%的脱脂奶粉浸泡，室温封闭1 h，加入新鲜配制且比例稀释好的PI3K（1∶1 000）、p-PI3K（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）抗体，4 ℃孵育过夜；第2天，取出目的条带，使用TBST清洗目的条带3次，每次5 min。清洗完成后，室温孵育二抗1 h，使用TBST清洗3次，每次5 min，滴加新鲜配制的ECL发光液进行显色，使用凝胶成像系统成像并运用Image J图像处理软件进行灰度值分析。

2.8 统计学分析

所有数据以均数±标准差（x±s）表示，使用Image J对蛋白条带进行灰度分析，并利用SPSS 23.0统计软件对各组灰度分析的数值进行统计分析。灰度分析的数据为连续数据，故采用单因素方差分析，同时满足方差齐性，使用LSD法进行两两比较。P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 糖利平胶囊活性成分的筛选结果

利用TCMSP数据库分别以香附、黄连、蚕沙为关键词检索糖利平胶囊的化学成分，并以化学成分的OB ≥ 30%且DL ≥ 0.18进行筛选，收集整理并去除重复成分后，得到糖利平胶囊29个活性成分。同时查阅相关文献，对糖利平胶囊中虽不满足ADME参数，但具有明确降血糖药理作用的成分进行补充，最终得到34个糖利平胶囊的活性成分。其中香附活性成分17个、黄连活性成分16个、蚕沙活性成分2个，香附和黄连共有活性成分1个^[15-18]，结果见表 1。

3.2 糖利平胶囊活性成分作用靶点预测

将糖利平胶囊34个活性成分的SMILES导入Swiss Target Prediction数据库进行作用靶点预测，分别从香附、黄连、蚕沙活性成分中筛选出442、483、23个靶点，整合去除299个重复靶点，共得到649个糖利平胶囊活性成分的作用靶点。

3.3 T2DM相关作用靶点获取

以“type 2 diabetes mellitus”为关键词分别在GeneCards、OMIM和TTD数据库中进行检索，其中在GeneCards数据库中得到15 025个糖尿病相关作用靶点，以“Relevance score”>2倍中位数为阈值，筛选出1 019个糖尿病相关作用靶点；在OMIM和TTD数据库中分别得到518个和97个糖尿病相关作用靶点，合并整理3个数据库检索结果，共获得1 633个糖尿病相关作用靶点，删除71个重复项，获得1 562个T2DM疾病相关作用靶点。

3.4 PPI网络构建及分析

将糖利平胶囊的649个活性成分作用靶点与1 562个T2DM疾病相关作用靶点导入VENN在线工具，取其交集并绘制韦恩图，得到193个共同靶点，见图 1。将得到的193个共同靶点导入STRING数据库构建PPI网络，见图 2。该网络包含193个节点、3 567种相互作用关系，其中节点大小和颜色深浅代表Degree值大小，节点越大、颜色越深，代表Degree值越大，靶点越关键。

利用Cytoscape 3.7.2平台对上述PPI网络进行拓扑参数分析。以Degree>2倍中位数（64）、Betweenness centrality>中位数（50.83）和Closeness centrality>中位数（0.54）作为筛选条件，筛选出30个糖利平胶囊治疗T2DM的核心靶点，其关键拓扑参数见表 2。

3.5 糖利平胶囊治疗T2DM核心靶点的富集分析

使用DAVID 6.8数据库对30个糖利平胶囊治疗T2DM的核心靶点进行GO功能富集分析（P＜0.05），共获得334个生物过程（BP）、39种细胞组分（CC）和50种分子功能（MF），对P值排名前10位（升序）的条目进行可视化，见图 3。其中，BP过程主要涉及对一氧化氮生物合成过程的正调控、异物刺激的反应等；CC条目主要涉及受体复合物、膜筏、胞质溶胶等；MF条目主要涉及相同蛋白质结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白磷酸酶结合等。

利用DAVID 6.8数据库对30个糖利平胶囊治疗T2DM的核心靶点进行KEGG通路富集分析，得到138条相关信号通路（P＜0.05），对P值排名前20位（升序）的信号通路进行可视化，见图 4。主要富集通路有PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、脂质与动脉粥样硬化（Lipid and atherosclerosis）、糖尿病并发症中的晚期糖基化终末化产物（AGE）-晚期糖基化终末产物受体（RAGE）信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂耐药性（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、低氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路（HIF-1 signaling pathway）等，表明糖利平胶囊可能通过多个信号通路治疗T2DM。此外，还发现一些非糖尿疾病通路，如疱疹病毒感染、人巨细胞病毒感染、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌等通路。

3.6 分子对接

利用PubChem数据库下载糖利平胶囊29个活性成分的SDF格式文件，利用Chem 3D对其进行优化后，导入AutoDockTools 1.5.7软件添加原子电荷，设置可旋转键，保存其PDBQT格式，作为对接配体。运用PDB蛋白质数据库下载核心靶点蛋白Akt1和EGFR的3D结构，再用PyMOL软件对核心靶点蛋白进行去水、删除原配体后，导入AutoDockTools 1.5.7软件对核心靶点蛋白进行加氢、计算电荷后保存，作为蛋白受体。将核心靶点Akt1和EGFR与糖利平胶囊的29个活性成分及阳性药二甲双胍进行分子对接，并记录其结合能，见表 3。一般认为结合能＜-5.0 kcal/moL表明配体活性成分与受体靶点蛋白之间存在较好的结合活性。由表 3可知，糖利平胶囊活性成分与受体靶点的结合能均＜-5.0 kcal/moL，说明糖利平胶囊活性成分与受体靶点可以稳定结合。阳性药二甲双胍与核心靶点Akt1、EGFR的结合能分别为-4.9、-5.1 kcal/moL，表明二甲双胍与Akt1、EGFR并没有较强结合。通过Discovery Studio软件将2个靶蛋白与最低分子结合能进行可视化处理，见图 5。

3.7 糖利平胶囊水提物对HepG2细胞活性的影响

采用CCK-8法检测糖利平胶囊水提物对HepG2细胞活性的影响，见图 6。与0 μg/mL糖利平胶囊水提物比较，50、100、200、400 μg/mL糖利平胶囊水提物对HepG2细胞活性无明显影响，说明糖利平胶囊水提物在400 μg/mL浓度下对HepG2细胞的活性没有影响，600、800、1 000 μg/mL的糖利平胶囊水提物能够显著降低HepG2细胞活性，影响其正常生长。故选择400 μg/mL的糖利平胶囊浓度进行后续实验。

3.8 糖利平胶囊对IR HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响

采用葡萄糖氧化酶法计算各组葡萄糖的消耗量，结果见图 7。与正常组比较，模型组HepG2细胞的葡萄糖消耗量明显减少（P＜0.01），表明HepG2 IR模型建立成功；与模型组比较，糖利平组和二甲双胍组HepG2细胞的葡萄糖消耗量显著增加（P＜0.05或P＜0.01），表明糖利平胶囊药物干预后可以改善IR HepG2细胞的IR状态。

3.9 糖利平胶囊对IR HepG2细胞PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组HepG2细胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，糖利平胶囊和二甲双胍干预后，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值显著升高（P＜0.01），见图 8。而PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt与PI3K/Akt信号通路相关，且Akt是糖利平胶囊治疗T2DM的核心靶点，故提示PI3K/Akt信号通路在糖利平胶囊治疗T2DM的过程中发挥重要作用。

4 讨论

糖尿病是临床常见的慢性代谢性疾病，属于中医“消渴”范畴。传统中医药理论认为其核心病机为阴虚内热，主张从肺、胃、肾论治^[19]。研究认为，肝的疏泄功能失调与糖尿病密切相关，肝郁是消渴病机的主要环节，其发生、发展尽管与肺、胃、肾关系密切，但主要以肝郁为始动因素，认为肝的疏泄功能失调与糖尿病密切相关，肝郁是消渴病机的主要环节，因此提出“从肝论治”“从瘀论治”的理论，确立了疏肝清热、活血化瘀的治则，配以理气、活血、化瘀之药，临床效果良好^[20-21]。糖利平胶囊是刘文峰教授根据多年临床经验总结出的经验方，由香附、黄连、蚕沙组成，具有疏肝理气、活血化瘀之效，切中糖尿病的基本病机。然而，糖利平胶囊治疗T2DM的作用机制尚未明确。

IR是T2DM（非胰岛素依赖型糖尿病）的主要发病机制之一，有效改善IR可以防治T2DM^[22]。IR是指胰岛素作用的靶组织和靶器官对胰岛素的敏感性降低或不敏感，诱发机体不断分泌胰岛素，促进外周组织加速葡萄糖摄取利用或抑制肝脏糖代谢能力，从而引起机体胰岛功能障碍，不能正常发挥降血糖作用^[23]。肝脏是人体最大的糖代谢器官，通过糖酵解、肝糖原的合成与分解、糖异生等途径参与机体对葡萄糖的代谢，是胰岛素作用的靶器官之一^[24]。肝脏作为重要的胰岛素靶器官，胰岛素受体密集，肝脏细胞数量众多，容易获取，因此被广泛用于建立体外IR模型。HepG2细胞系是一种表型与肝细胞极为相似的人肝胚胎瘤细胞株，能够较理想地模拟体内葡萄糖和脂肪酸的代谢环境，且由HepG2细胞建立的IR模型是公认的研究IR发生机制的理想模型^[25]。研究表明，高浓度的胰岛素作用HepG2细胞，使得HepG2细胞表面的胰岛素受体数目减少，且减少程度与胰岛素浓度及其作用时间呈正相关^[26]。因此，本研究选择高浓度胰岛素建立IR HepG2细胞模型。

本研究网络药理学结果显示，糖利平胶囊可以通过异鼠李素、β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素、槲皮素、小檗碱、β-胡萝卜素等主要活性成分干预T2DM。研究表明，β-谷甾醇可以通过激活肝激酶B1（LKB1）介导的腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）活化，改善葡萄糖和脂质代谢^[27]。山柰酚具有降血糖、抗氧化、抗炎等药理作用，它不仅可以促进骨骼肌葡萄糖代谢，抑制肝糖异生，亦可通过改善细胞胰岛素敏感性，激活胰腺β细胞的胰岛素分泌，发挥降糖作用^[28]。木犀草素可以通过改善IR、恢复胰岛β细胞功能、抑制肠道糖脂吸收等多种途径防治糖尿病^[29]。槲皮素可以通过降低机体氧化应激水平，减轻胰岛细胞凋亡，从而发挥降糖作用，还可以通过p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信号通路改善T2DM小鼠视网膜组织氧化应激损伤和炎症反应，亦可通过增强足细胞nephrin和podocin表达发挥对糖尿病大鼠的肾脏保护作用^[30-31]。β-胡萝卜素可以有效提高糖尿病大鼠的抗氧化能力，减少脂质过氧化产物生成，发挥治疗T2DM作用^[32]。Jiang等^[33]研究发现，异鼠李素可以通过激活Janus激酶2（JAK2）通路促进葡萄糖摄取，维持葡萄糖水平稳定。上述研究提示糖利平胶囊的活性成分能够通过多种途径治疗T2DM。

PPI网络构建分析发现，糖利平胶囊治疗T2DM的核心靶点Degree值排名靠前的有Akt1、肿瘤坏死因子（TNF）、EGFR、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、白细胞介素-1β（IL-1β）等。Akt1属于丝氨酸/苏氨酸激酶的Akt亚家族，作为胰岛素信号通路的关键靶点，可以被多种酶、生长因子及细胞因子激活，其中Akt1磷酸化可以促进糖原合成、葡萄糖转运和摄取、蛋白质生物合成等；Akt1被PI3K激活后，可以通过刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，调节体内葡萄糖稳态平衡^[34]。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是炎症反应的主要调节因子，参与体内免疫平衡调节过程。研究发现TNF-α可以直接作用于胰岛β细胞，产生一氧化氮，进而导致机体发生IR^[35]。临床研究证实单纯T2DM患者血清TNF-α水平高于健康对照组^[36]。EGFR属于酪氨酸激酶型受体，被激活后能够上调活性氧（ROS）的产生和内质网应激，在糖尿病肾病的发病中发挥关键作用^[37]。STAT3是T2DM的关键转录因子，它可以通过调控SREBP-1c和PI3K/Akt通路来抑制肝脏脂质生成和糖异生，提高糖原合成^[38]。IL-1β是机体炎症反应的主要调节因子，可以导致胰岛β细胞功能障碍，被认为是T2DM发病的重要因素。据文献报道，糖尿病视网膜病变患者外周血的单核细胞炎症小体成分IL-1β蛋白表达出现升高^[39]。本研究分子对接结果显示，糖利平胶囊的活性成分与Akt、EGFR均具有良好的结合活性。故推测Akt1、TNF、EGFR、STAT3、IL-1β等可能是糖利平胶囊治疗T2DM的关键靶点。

此外，KEGG富集分析和分子对接结果表明，糖利平胶囊干预T2DM可能与PI3K/Akt信号通路相关，且体外实验也证实了这一观点，糖利平胶囊能够通过激活PI3K/Akt信号通路改善IR HePG2细胞的耐胰岛素情况。PI3K/Akt信号通路是肝细胞胰岛素转导的重要信号通路之一，PI3K与细胞膜表面发生磷酸化的胰岛素受体底物1结合，并激活Akt，进而调控下游通路的相关蛋白，如叉头框蛋白-O1（FoxO1）等，维持血糖平衡及脂质代谢^[40]。PI3K是一种传递胰岛素朝向的关键因子，可以修复胰岛β细胞损伤，调节血糖水平，从而维持葡萄糖和脂质代谢稳定。若PI3K/Akt信号通路传导出现异常，可以导致IR。贾小玉等^[41]研究发现黄连中的小檗碱干预T2DM模型大鼠后，T2DM大鼠血清代谢指标（FBG、FINS）显著下降，PI3K和Akt蛋白的相对表达水平升高，表明小檗碱可能通过激活PI3K/Akt信号通路，抑制T2DM疾病发展。此外，三黄泻心汤干预T2DM小鼠后，可以通过PI3K-Akt-FoxO信号通路，抑制肝脏葡萄糖生成，降低T2DM小鼠的FBG水平，并增加糖原储存，从而发挥治疗T2DM的作用^[42]。与本研究结果一致，激活PI3K-Akt信号通路可以改善T2DM症状。分子对接研究发现，糖利平胶囊中的29个活性成分与核心靶点Akt、EGFR具有较强的结合力，反向验证了糖利平胶囊的活性成分在T2DM治疗中发挥了关键作用。但本研究只进行了体外实验，未能获得体内实验或临床试验提供的有效数据，导致结果缺少数据支持。未来将在生物体内验证糖利平胶囊抗T2DM作用，并对PI3K/Akt信号通路进行干预，以此验证糖利平胶囊是否真正通过激活PI3K/Akt信号通路干预T2DM。

综上，本研究通过网络药理学、分子对接和实验验证，明确异鼠李素、β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素、槲皮素、小檗碱、β-胡萝卜素为糖利平胶囊干预T2DM的主要活性成分，且激活PI3K/Akt信号通路为其发挥抗T2DM的主要作用机制。本研究为糖利平胶囊的临床应用提供了理论依据，且为后续糖利平胶囊抗T2DM机制的探究提供了方向。但本实验只进行了离体细胞研究，没有在动物体内进行研究，存在不足之处。后续将采用整体动物实验进行验证，并对糖利平胶囊促进IR HepG2细胞的葡萄糖消耗量的机制进行深入研究。