2025, Vol. 44文章信息
- 赵薇, 徐兴娣, 刘秀苹, 张金君, 孙娜, 苗琳
- ZHAO Wei, XU Xingdi, LIU Xiuping, ZHANG Jinjun, SUN Na, MIAO Lin
- 清金益气方对金黄色葡萄球菌诱导大鼠急性咽炎的作用研究
- Study on the effects of Qingjin Yiqi Decoction on Staphylococcus aureus-induced acute pharyngitis in rats
- 天津中医药大学学报, 2025, 44(11): 1004-1016
- Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2025, 44(11): 1004-1016
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2025.11.06
-
文章历史
收稿日期: 2025-05-06
2. 省部共建组分中药国家重点实验室, 天津中医药大学, 天津 301617;
3. 现代中药创制全国重点实验室, 天津中医药大学, 天津 301617
2. State Key Laboratory of Component-based Chinese Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China;
3. State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine Creation Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China
急性咽炎（acute pharyngitis，AP）是临床常见的上呼吸道感染中之一，具有发病急，病程短的特点[1]，主要发生于咽部黏膜及黏膜下组织[2]，临床表现为咽痛、咽部黏膜红肿，咽部咳痰等炎症反应[3]。研究发现：AP发病因素主要包括病毒[4]或细菌感染[5]，除此之外也包括非感染因素如高温粉尘、刺激性气体等。根据2021年中国疾病控制中心发布的一项针对呼吸道传染病的报告显示，全国AP的发病率超过20%[6]。特别地，在新冠肺炎康复期，呼吸道炎症也是其重要的临床表现[7]。此外，AP发病时咽部淋巴结或黏膜过度肿大、咽部分泌物增多亦容易引起咽部阻塞和呼吸困难等突发状况[8]。临床上AP治疗多以抗生素为主[9]，然而过度使用抗生素可导致耐药性、生态菌群紊乱等问题[10]，因此寻找特异、安全有效的AP治疗药物具有临床意义。
呼吸道病原体感染可引发先天性和适应性免疫系统的激活，导致细胞因子分泌的增加和炎症反应[11]。研究显示，咽炎患者CD4+ T淋巴细胞及CD4+/CD8+比值明显下降，CD8+ T淋巴细胞比例显著升高[12]。特别地，在咽炎发展过程中黏膜免疫也处于高度激活状态，可以通过黏膜下淋巴组织中浆细胞合成和分泌免疫球蛋白A（IgA）[13]，并进一步由上皮细胞分泌形成分泌型免疫球蛋白A（SIgA），通过抑制病原体粘附到黏膜表面，保持黏膜完整性[14]。研究显示[15]：75%~85%的鼻咽炎患者中黏膜SIgA水平低于正常人群，提示其呼吸道黏膜免疫功能低下[16]。因此提高SIgA水平也成为了评价药物是否可以抑制AP的重要指标[17-18]。
大量文献证实，咽炎患者血清中炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β等水平显著升高[19]。动物实验研究发现，氨水[20]和化脓链球菌（S. pyogenes）[21]诱导的AP大鼠都出现咽组织炎症细胞大量浸润，炎症因子TNF-α和IL-6水平显著升高及炎症信号通路的高度激活。在金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）诱导的咽炎小鼠模型中，亦发现炎症因子和炎性介质PGE2的增加[5]，同时还伴随有淋巴细胞和中性粒细胞的激活[22]。
气道上皮具有对抗细菌病原体的基本炎症、免疫和再生能力，可在呼吸道黏膜表面分泌黏蛋白5AC（MUC5AC）形成黏液层，帮助清除病原体并减少与上皮细胞的接触[23]，对维持呼吸道黏膜免疫稳态至关重要[24]。然而炎症发生时过多的黏液也会进一步加剧气道炎症性疾病的临床表现。研究表明，MUC5AC的异常表达是慢性阻塞性肺疾病（COPD）、哮喘等呼吸系统疾病的标志物[25-26]。另外，报道显示由屋尘螨诱导的哮喘小鼠和活鼻病毒诱导的COPD小鼠的气管和肺组织中MUC5AC表达明显升高[27-28]。IL-1β、EGF和细菌产物等诱导NCI-292细胞中MUC5AC的高表达[29-31]。
清金益气方（QJYQ）是由张伯礼院士围绕新冠肺炎康复期呼吸道症状开具的处方，包含人参、麦冬、五味子、茯苓、半夏、薏苡仁、玄参、苍术、陈皮、甘草、柴胡、升麻、黄芩、马鞭草、芦根和淡竹叶共16味中药，具有益气养阴，清热利湿，健脾和中的功效，可用于调节机体免疫功能[32]。前期药理学研究证实，清金益气方具有抗病毒和免疫调节的作用[33]，但其对AP的作用及其是否与炎症和黏蛋白表达相关尚未见报道。本课题首先在动物水平建立S. aureus诱导的AP大鼠模型，考察QJYQ抑制大鼠AP的作用，在细胞水平进一步验证QJYQ的抗炎和抑制MUC5AC表达的作用，为QJYQ在治疗AP的临床应用提供药理学数据支持。
1 材料 1.1 药物与细胞QJYQ由天津中医药大学现代中药创新中心提供，批号SJX2020001。QJYQ提物临床用量为104 g/天，出膏率为18%，即QJYQ的临床剂量为104 g×0.18/70 kg（成人体质量按照70 kg计算），人与大鼠换算系数为6.3，即大鼠与人临床给药的等效剂量=267.43 g/70 kg×6.3=1.685 g/kg。实验采用2倍临床剂量，3.4 g/kg。阿莫西林（Amoxicillin，Amoxil），购自山东淄博新达制药有限公司。批号191040。实验采用临床等效剂量，0.36 g/kg。金黄色葡萄球菌标准菌株购自ATCC，货号6538。以上均4 ℃避光保存。
人肺癌细胞（淋巴结转移）NCI-H292细胞购自普诺赛生命科技有限公司。
1.2 试剂苏木精-伊红（HE）染色试剂盒、AB-PAS染色试剂盒、EB染液（北京索莱宝科技有限公司，#G1120，#G1285，#G1810）；甲酰胺溶液（美国MCE生物科技公司，#HY-Y0842）；大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、IgA、SIgA ELISA试剂盒（北京博奥拓达生物科技有限公司，#TOPEL02868，#TOPEL02652，#TOPEL02879，#TOPEL02679，#TOPEL02673，#TOPEL02545）；山羊抗小鼠IgG（H+L）荧光二抗（武汉博士德生物工程有限公司，#16G27C）；RNA提取试剂盒，反转录试剂盒（天津翌圣生物科技有限公司，#19211ES60，#11139ES60）；qPCR试剂盒（美国Promega公司，A6002）；澳洲胎牛血清（美国Invigentech公司，A6907FBS）；RPMI-1640培养液（以色列Biological Industries公司，01-106-1A）；青霉素和链霉素（美国Gibco公司，15140122）；CD4+ 抗体和CD8+抗体（美国BioLegend公司，#201520，#201703）；抗E-cadherin抗体（美国Cell Signaling Technology公司，#14472）；MUC5AC抗体（美国Novus公司，#NBP2-15196）；脂磷壁酸（LTA）（美国Sigma-Aldrich公司，#L2515）；CCK-8试剂盒（上海翌圣生物科技股份有限公司，#35301205）；LDH试剂盒（北仁化学科技北京有限公司，#CK12）。
1.3 实验动物24只SPF级雄性SD大鼠，质量为180~220 g，购自北京华阜康生物技术有限公司，合格证号：110322230101674074。本实验程序经天津中医药大学动物研究委员会批准（TCM-LAEC2023175），饲养于天津中医药大学动物中心。
1.4 实验仪器离心机（美国Tektronx公司，7500244575002445，R=10 cm），流式细胞仪（美国BD公司，FACS Calibur），TECAN酶标仪（北京海天友诚科技公司，INFINTE F50），Nikon荧光显微镜（上海泽仕光电科技有限公司，E400），Bio-Rad实时定量PCR仪（美国Bio-Rad公司，CFX96）。
2 实验方法 2.1 细菌培养挑取金黄色葡萄球菌菌落接种于含有LB液体培养基中，37 ℃振荡16 h。随后将菌液离心1 min，弃上清，加入新培基重悬细菌沉淀，混匀，调整菌液浓度为1.0×108 CFU/mL。
2.2 AP大鼠模型的建立及给药将24只大鼠随机分为4组，每组6只，分别为对照组、模型组、清金益气方组和阿莫西林组。清金益气方组（3.4 g/kg）预给药3天后，对照组注射生理盐水，其余大鼠连续2天在咽部注射S. aureus（2×107 CFU/天），造模后对照组和模型组继续灌胃生理盐水，清金益气方组和阿莫西林组（0.36 g/kg）分别灌胃给药，并持续7天。末次给药1 h后称质量，观察下列指标。
2.3 大鼠表观行为指标打分末次给药1 h后，观察每只大鼠的行为特征，并根据以下标准进行评分（表 1）。
末次给药1 h后，根据病理评分标准观察大鼠咽部黏膜颜色、充血肿胀和唾液分泌进行评分（表 2）。
对照组、模型组和清金益气方组大鼠随机挑选3只大鼠，麻醉后，尾静脉注射EB染料（30 mg/kg）染色1 h。然后将咽部组织破碎，在甲酰胺溶液中孵育24 h，55 ℃，吸取上清，测量620 nm处的吸光度。
2.6 取材大鼠麻醉后腹主动脉取血，用抗凝采血管取2 mL送检血常规，同时取5 mL置于促凝采血管中常温离心15 min，3 500 r/min（离心半径为10 cm），取上清液，-80 ℃保存。取血后，暴露胸腔，结扎气管最后一节，将1 mL PBS注入，缓慢回抽注射器，再如此反复3次所得的气管灌洗液（tracheal lavage fluid，TLF），回收率在80%左右。将TLF于离心机1 000 r/min（离心半径10 min）。将细胞沉淀用100 μL PBS重悬，用于中性粒细胞和白细胞计数，上清-80 ℃保存，用于后续指标检测。分离取出胸腺组织，精确称量组织的湿重，并按照脏器指数公式计算胸腺指数，计算公式：脏器湿质量（g）/大鼠体质量（g）×100%。
2.7 病理学检测取大鼠咽部和气管于10%中性缓冲福尔马林固定液24 h以上；将脱水盒于脱水机内依次梯度乙醇进行脱水；将浸好石蜡的组织放在包埋机内进行包埋；并切下片厚5 μm的切片。用二甲苯使石蜡切片脱蜡，经各级乙醇后至水洗，后用HE染色，并在光学显微镜下观察，以评估组织病理学的变化。
2.8 酶联免疫吸附法实验前将血清置于冰上复融，按照ELISA试剂盒操作检测大鼠血清中免疫球蛋白IgA和TLF中SIgA含量。
2.9 阿利新蓝-过碘酸-雪夫染色将切片放入60 ℃的恒温箱中60 min；切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、梯度乙醇脱蜡至水；阿利新蓝染色液染色4 min，自来水洗3次，2 min/次；放入氧化剂中进行氧化5 min。自来水冲洗1 min，蒸馏水浸洗2次，15 s/次；Schiff染色液浸染8 min，用水冲洗8 min；苏木素染色液染核1 min，水洗；用酸性分化液分化2 s，水洗；用Scott蓝化液返蓝2 min，水洗2 min；脱水封片，中性树胶封固，镜下观察。
2.10 流式细胞术从抗凝管中取全血100 μL至含1.5 mL的离心管中；加300 μL红细胞裂解液/管，涡旋5秒，冰上孵育15 min；离心10 min 4 ℃，2 200 r/min，弃上清；加200 μL红细胞裂解液吹匀，4 ℃，2 200 r/min，离心10 min弃上清；加1 mL细胞缓冲液吹匀，4 ℃，2 200 r/min，离心5 min，弃上清；抗体染色：每100 μL细胞悬液加入抗体PerCP-CD4和FITC-CD8，4 ℃避光孵育30 min；上机：加1 mL PBS重悬，瞬离，弃去上清，上述操作（离心半径为10 cm）加500 μL PBS重悬，用流式细胞仪检测全血中T淋巴细胞亚群的数量。
2.11 免疫荧光染色将组织切片放入60 ℃的恒温箱中60 min；切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、梯度乙醇脱蜡至水；微波热修复后，缓慢冷却至室温。TBST洗3次，5 min/次；用5%BSA覆盖组织，37 ℃孵育30 min；滴加E-cadherin一抗（1∶200），盖膜，4 ℃孵育过夜；将湿盒室温放置30 min，滴加二抗覆盖组织，盖膜，37 ℃孵育1 h，TBST洗4次，5 min/次；滴加抗荧光衰减封片剂，于荧光显微镜下观察并采集图像。
在24孔板中放入圆形盖玻片，以1.5×105个/mL的密度种板，80%以上的细胞贴壁后加入500 μg/mL QJYQ，培养4 h后加入5 μg/mL的LTA，放入37 ℃孵箱中分别培养48 h后，用1×PBS漂洗除去未贴壁细胞；室温下，在4%多聚甲醛中孵育细胞10 min，PBST洗3次；加入1% BSA封闭液，室温孵育30 min；滴加E-cadherin一抗（1∶200），MUC5AC一抗（1∶800）盖膜，4 ℃孵育过夜，后续步骤同组织切片实验一致。
2.12 细胞培养NCI-H292细胞用含10%FBS和1%青链霉素RPMI1640培养液培养。NCI-H292细胞以1×105/mL密度接种于6孔板，80%以上的细胞贴壁后加入500 μg/mL QJYQ，继续培养4 h后加入5 μg/mL的LTA，继续放入37 ℃孵箱中分别培养4 h、24 h后，分别检测IL-1β和MUC5AC mRNA表达。
2.13 NCI-H292细胞活力和毒性实验在96孔板中以1×105个/mL种板，细胞贴壁后即可加入不同浓度的QJYQ（0、100、200、400、500 μg/mL），每个浓度都设置6个复孔，完成加药后，放入37 ℃细胞培养箱中培养24 h。24 h后，加入CCK-8后于37 ℃中避光孵育30 min，450 nm下测定OD值，加入LDH于37 ℃中避光孵育15 min，490 nm下测定OD值，作图分析数据，确定药物作用于NCI-H292细胞的最佳药物浓度。
2.14 RT-qPCR参照试剂盒说明书进行RNA提取，使用酶标仪检测细胞中RNA浓度。根据逆转录反应试剂盒制备反应体系，25 ℃ 5 min，55 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。按照qPCR反应试剂盒进行RT-qPCR实验。RT-PCR的反应条件为：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s共循环40次。熔解曲线：56 ℃到95 ℃之间。获得每个样品的Ct值，计算得到2-ΔΔCt的数值进行统计。实验中的引物序列见表 3。
| 基因 | 引物5’-3’ |
| IL-1β | 上游：ATGGCTTATTACAGTGGCAATGAG |
| 下游：GTAGTGGTGGTCGGAGATTCG | |
| MUC5AC | 上游：GCTTCCTGCTCCGAGATGT |
| 下游：AAGACGCAGCCCTCATAGAA | |
| β-actin | 上游：CCAACCGCGAAGAAGATGA |
| 下游：CCAGAGGCGTACAGGGATAG |
实验数据通过GraphPad Prism 8.0.1软件进行分析，数据表示为均值±标准差（x±s）。利用Shapiro-Wilk test检测数据是否符合正太分布，符合正态分布的数据结果采用单因素方差分析数据（One-way ANOVA）。当P＜0.05认为结果有统计学意义，当P＜0.01认为结果有统计学极显著意义。
3 结果 3.1 清金益气方提高AP大鼠体质量、胸腺指数，改善活动能力、皮毛色泽、咽部病变等表观指标为了评价清金益气方对S. aureus诱导的AP大鼠模型中的作用，按照图 1a完成了体内实验。如所示，在第11天时，与对照组相比，模型组体质量（图 1b）和胸腺指数（图 2a）显著降低；分别给药清金益气方和阿莫西林后大鼠的体质量的降低得到明显逆转（P＜0.001，P＜0.001）；胸腺指数也有较为显著回升（P＜0.05，P＜0.05）。与对照组相比，模型组组皮毛色泽及活动能力（图 2b）显著降低，咽部黏膜光泽度较差，组织病变明显，黏膜分泌物较多，并伴有中度充血、肿胀（图 2c）；与模型组相比，清金益气方组大鼠皮毛色泽、活动能力均得到显著改善（P＜0.05，P＜0.001），咽部伴有少量分泌物，存在轻度充血和肿胀的现象；阿莫西林组也出现了相似的恢复情况。
|
| 注：与对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，###P＜0.001。图a，清金益气方治疗AP示意图；图b，大鼠体质量，n=6。 图 1 清金益气方对AP大鼠体质量的影响 |
|
| 注：与对照组比较，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。图a，胸腺指数；图b，表观指标；图c，咽部病变，n=6。 图 2 清金益气方对AP大鼠胸腺指数、活动能力、皮毛色泽和咽部病变的影响 |
对照组咽部EB染料的外渗程度很小，模型组咽部黏膜有大量EB染料的外渗，给药后清金益气方组染色明显减少（P＜0.01）（3a，3b）。如图 3c所示，与对照组大鼠相比，模型组大鼠咽部组固有层和黏膜下血管增多、充血，并见大量炎性细胞浸润，腺体壁相比正常组明显增厚；清金益气方组腺体壁恢复到正常水平，黏膜和黏膜下炎性细胞浸润程度明显减少，肌层纤维排列紧密。与对照组相比，模型组大鼠气管病变同样可见，模型组气管纤毛缺失、炎症细胞浸润、黏膜下上皮明显，而给药清金益气方后均明显改善，阿莫西林组大鼠恢复情况与清金益气方组大鼠相似，咽部和气管病变都有所改善。
|
| 注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P＜0.01。图a，咽黏膜损伤；图b，咽黏膜损伤量化，n=3；图c，咽和气管病理状态，n=6。 图 3 清金益气方对AP大鼠咽和气管病理状态的影响 |
与对照组相比，模型组外周血中WBC数目和中性粒细胞比例显著升高（图 4a）；TLF中WBC数目和中性粒细胞比例显著升高（图 4b）；与模型组相比，清金益气方有效抑制外周血和TLF中WBC数目（P＜0.05，P＜0.001）和中性粒细胞比例的增加（P＜0.01）。如图 5a所示，与对照组相比，模型组外周血中CD4+ T淋巴细胞比例显著降低，CD8+ T淋巴细胞比例显著增加，CD4+/CD8+的比值显著降低（图 5b）。与模型组相比，清金益气方组CD4+ T淋巴细胞比例有上调的趋势，CD8+ T淋巴细胞比例有减少的趋势，CD4+/CD8+的比值得到明显的改善（P＜0.01）。定量了血清中IgA（图 6a）和TLF中的SIgA水平（图 6b）。与对照组相比，模型组血清中IgA水平显著升高，TLF中SIgA水平出现显著的降低；与模型组相比，清金益气方治疗后IgA水平显著降低（P＜0.01），SIgA水平显著回升（P＜0.001）。阿莫西林组也出现相似的趋势，但无统计学意义。
|
| 注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。图a，外周血；图b，气管灌洗液，n=6。 图 4 清金益气方对AP大鼠白细胞和中性粒细胞的影响 |
|
| 注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型组比较，##P＜0.01。图a，外周血中CD4+，CD8+ T淋巴细胞亚群比例；图b，CD4+/CD8+比值的变化，n=6。 图 5 清金益气方对AP大鼠淋巴细胞的影响 |
|
| 注：与对照组比较，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型组比较，##P＜0.01，###P＜0.001。图a，外周血中IgA水平；图b，TLF中SIgA水平，n=6。 图 6 清金益气方对AP大鼠IgA和SIgA水平的影响 |
与对照组相比，模型组咽部黏膜下腺中黏液总蛋白的面积增多；与模型组相比，清金益气方组黏膜下腺中黏液蛋白的表达减少明显（图 7a）。如图 7b所示，与对照组相比，模型组咽、气管组织和TLF中MUC5AC水平均显著升高；与模型组相比，清金益气方组咽、气管组织和TLF中MUC5AC水平的升高均有明显的抑制（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001）。
|
| 注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型组比较，###P＜0.001。图a，咽部黏液蛋白表达；图b，咽、气管组织和TLF中MUC5AC水平，n=6。 图 7 清金益气方对AP大鼠黏液蛋白表达的影响 |
与对照组相比，模型组咽部组织E-cadherin表达降低，清金益气方组咽组织中E-cadherin的表达得到明显增加（图 8a）。如图 8b所示，与对照组相比，模型组血清中炎症因子IL-1β（P＜0.001），PGE2（P＜0.05），IL-6（P＜0.001）和TNF-α（P＜0.001）水平均显著升高；与模型组相比，清金益气方组大鼠血清中IL-6，IL-1β，TNF-α和PGE2水平的升高均得到显著的抑制；阿莫西林组也有相似的趋势。
|
| 注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。图a，咽部E-cadherin表达（100×）；图b，血清中炎症因子IL-1β、PGE2、IL-6和TNF-α水平，n=6。 图 8 清金益气方对AP大鼠E-cadherin表达和炎症因子水平的影响 |
100、200、400、500 μg/mL浓度的清金益气方对NCI-H292细胞活力均无明显影响（图 9），后续实验选用500 μg/mL清金益气方的浓度进行下一步探究。如图 10a结果显示，LTA诱导NCI-H292细胞中E-cadherin的表达降低，给药QJYQ后，可以明显逆转E-cadherin的低表达。如图 10b所示，LTA诱导的NCI-H292细胞中IL-1β（P＜0.01）和MUC5AC的mRNA表达升高可被QJYQ显著降低。
|
| 注：与对照组比较，*P＜0.05。图a，细胞活力；图b，细胞毒性，n=3。 图 9 清金益气方对NCI-H292细胞活力和毒性的影响 |
|
| 注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与脂磷壁酸组比较，##P＜0.01。图a，E-cadherin表达；图b，IL-1β和MUC5AC mRNA表达，n=3。 图 10 清金益气方对LTA刺激的NCI-H292细胞中E-cadherin表达和IL-1β、MUC5AC mRNA表达的影响 |
AP是最常见的上呼吸道炎症反应，其中细菌性咽炎大约占AP的25%[34]。已有文献报道，S. pyogenes是细菌性咽炎中最常见的致病菌[35]，美国每年约有500万患者感染S. pyogenes咽炎[36]。同样，S. aureus也被认为是引发咽炎的重要病原体，在鼻、咽部定植[37]。在临床表现上，S. pyogenes或S. aureus诱导的AP均为咽痛红肿、咳嗽和喉中有异物感，上呼吸道黏膜免疫高度激活和过度炎症，以及咽黏膜损伤[9, 20]。本课题建立了由S. aureus诱导大鼠AP模型，进一步考察药物对细菌性咽炎的治疗效果具有一定的代表性。
AP是一种以炎症和上皮损伤为特征的炎症性气道疾病[38]。AP患者感染初期外周血中中性粒细胞表达上调[3]，并产生大量细胞因子[11]。有研究指出，S. pyogenes咽炎患者外周血中，CD4+ T淋巴细胞减少，但CD8+ T淋巴细胞不变[39]。本研究发现，AP大鼠的WBC数目及中性粒细胞比例都有显著的升高（4a，4b）。此外，还发现AP大鼠CD4+和CD8+ T淋巴细胞在外周血中被激活（图 5a，5b），这表明T淋巴细胞参与了S. aureus诱导的AP大鼠的免疫反应。IgA源性SIgA抗体是由黏膜上皮下浆细胞产生的主要抗体[40]，可与pIgR受体结合，通过基底外侧上皮细胞中分泌[16]，在调节黏膜免疫平衡中发挥作用[41]。已有研究也报道了AP患者支气管肺泡灌洗液中SIgA出现明显减少[42]；S. aureus感染的奶牛中SA SIgA水平和肺炎链球菌（S. pneumoniae）感染的肺炎小鼠中S. pneumoniae-specific SIgA水平亦被抑制[43-44]。研究也证实AP大鼠外周血中总IgA的含量明显增加，TLF中SIgA水平显著减少（图 6a，6b），提示AP发展进程中黏膜免疫功能受损。
炎症反应参与了AP发生发展过程。在S. aureus诱导的咽炎小鼠[5]和在氨水诱导的咽炎大鼠[36, 45]中炎症因子水平均有显著升高，包括IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2。与先前报道一致，我们的研究发现IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2水平亦显著增加（图 8b）。此外，上皮损伤和黏液分泌增多也是AP常见的病理改变。E-cadherin表达减少导致气道上皮屏障功能障碍在哮喘小鼠和COPD大鼠中都很常见[35, 46]。研究数据显示，AP大鼠咽部上皮组织中E-cadherin的表达也明显降低（图 8a）。炎症加重了气道疾病的症状，几乎所有气道炎症都会发生黏液功能障碍[28, 47]。MUC5AC是气道上皮杯状细胞中的主要分泌型黏蛋白[48]，具有维持黏膜完整性和黏膜屏障的功能[30]，过多的黏蛋白表达和分泌可导致黏液积聚损害气道功能[49]，MUC5AC也被认为是包括COPD和哮喘等呼吸道疾病严重程度重要标志物[50-51]。在S. aureus诱导的AP大鼠模型发现，AP大鼠咽部中出现明显的红肿和分泌物（图 2c），咽部黏膜明显损伤（图 3a，3b）；咽部和气管组织上皮下血管增多、充血，以及炎性细胞浸润，腺体壁增厚（图 3c），咽部黏液蛋白明显增加（图 7a），咽、气管和TLF中的MUC5AC的蛋白含量显著升高（图 7b）。
前期研究证实，QJYQ具有抗病毒和免疫调节的作用[33]。临床研究亦表明，QJYQ可有效改善发热乏力、咽痛咳嗽等临床症状[52]。但是是否能直接抑制AP尚不清楚。该论文首次发现给药QJYQ可以明显改善AP大鼠的表观指标（图 1，图 2），减轻咽黏膜损伤（图 3a，3b）和咽部和气管病理损伤（图 3c），提示QJYQ具有改善S. aureus诱导的大鼠AP症状的作用。进一步，还证实QJYQ可以抑制AP大鼠WBC数目及中性粒细胞比例的异常升高（图 4a，4b）；大鼠外周血中CD4+ T淋巴细胞比例的减少和CD8+ T淋巴细胞比例的增加以及CD4+/CD8+比值的降低也得到明显抑制（图 5）。现有的一些中药亦在抗呼吸系统感染过程中通过提高SIgA水平发挥作用。活血利咽汤通过提高SIgA水平提高患者黏膜免疫功能[18]。健脾利咽汤通过增加SIgA含量增强机体局部免疫能力[15]。临床麻黄细辛汤通过调节SIgA免疫应答保护感染甲型流感病毒小鼠[53]。在本研究中证实，QJYQ对IgA水平的增加以及SIgA水平的降低也具有很好的抑制效果（图 6）。QJYQ还可上调AP大鼠咽组织E-cadherin的表达（图 8a），降低炎症因子IL-1β、PGE2、TNF-α和IL-6的水平（图 8b）；抑制咽部、气管和TLF中MUC5AC水平（图 7b）。综上所述，我们首次证实了QJYQ可以改善S. aureus诱导的大鼠AP的发生发展。
已有文献报道，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌上清液的可以刺激NCI-H292细胞中MUC5AC表达[30]。在本研究中我们采用金黄色葡萄球菌来源的细胞壁成分脂磷壁酸（LTA）刺激NCI-H292细胞，诱导上皮细胞损伤[54]、屏障功能障碍和炎症反应。此外，炎症应答与组织损伤程度具有相关性，本研究发现LTA刺激后NCI-H292细胞中E-cadherin表达降低（图 10a），IL-1β和MUC5AC的mRNA表达显著升高（图 10b），QJYQ可以抑制E-cadherin表达，还可显著抑制IL-1β和MUC5AC的异常表达。
综上，本研究证实了QJYQ可通过调节IgA及SIgA水平，减少MUC5AC表达抑制S. aureus诱导的大鼠AP，提示QJYQ可作为治疗咽炎等上呼吸道感染相关疾病的候选用药，但是还缺乏更加深入全面的研究，因此后续有待进一步研究。
| [1] |
MORIYAMA M, HUGENTOBLER W J, IWASAKI A. Seasonality of Respiratory Viral Infections[J]. Annual review of virology, 7(1): 83-101. DOI:10.1146/annurev-virology-012420-022445 |
| [2] |
AALBERS J, O'BRIEN K K, CHAN W S, et al. Predicting streptococcal pharyngitis in adults in primary care: a systematic review of the diagnostic accuracy of symptoms and signs and validation of the Centor score[J]. BMC Medicine, 2011, 9: 67. DOI:10.1186/1741-7015-9-67 |
| [3] |
LINDGREN C, NEUMAN M I, MONUTEAUX M C, et al. Patient and Parent-Reported Signs and Symptoms for Group A Streptococcal Pharyngitis[J]. Pediatrics, 2016, 138(1): e20160317. DOI:10.1542/peds.2016-0317 |
| [4] |
FALSEY A R, WALSH E E. Respiratory syncytial virus Prefusion F vaccine[J]. Cell, 2023, 186(15): 3137-3137. DOI:10.1016/j.cell.2023.05.048 |
| [5] |
JIA G, LIU X, CHE N, et al. Human-origin Lactobacillus salivarius AR809 protects against immunosuppression in S. aureus-induced pharyngitis via Akt-mediated NF-κB and autophagy signaling pathways[J]. Food & Function, 2020, 11(1): 270-284. |
| [6] |
LI Z J, ZHANG H Y, REN L L, et al. Etiological and epidemiological features of acute respiratory infections in China[J]. Nature Communications, 2021, 12(1): 5026. DOI:10.1038/s41467-021-25120-6 |
| [7] |
TORIBIO-AVEDILLO D, GÓMEZ-GÓMEZ C, SALA-COMORERA L, et al. Monitoring influenza and respiratory syncytial virus in wastewater. Beyond COVID-19[J]. The Science of the total environment, 2023, 892: 164495. DOI:10.1016/j.scitotenv.2023.164495 |
| [8] |
BEAM J E, WAGNER N J, LU K Y, et al. Inflammasome-mediated glucose limitation induces antibiotic tolerance in Staphylococcus aureus[J]. Iscience, 2023, 26(10): 107942. DOI:10.1016/j.isci.2023.107942 |
| [9] |
BERKLEY J. Management of Pharyngitis: Should America Fall in Line With the Rest of the Developed World?[J]. Circulation, 2018, 138(18): 1920-1922. DOI:10.1161/CIRCULATIONAHA.118.035900 |
| [10] |
HOWDEN B P, GIULIERI S G, WONG FOK LUNG T, et al. Staphylococcus aureus host interactions and adaptation[J]. Nature Reviews Microbiology, 2023, 21(6): 380-395. DOI:10.1038/s41579-023-00852-y |
| [11] |
METTELMAN R C, ALLEN E K, THOMAS P G. Mucosal immune responses to infection and vaccination in the respiratory tract[J]. Immunity, 2022, 55(5): 749-780. DOI:10.1016/j.immuni.2022.04.013 |
| [12] |
范秀东, 杨雪, 任晓楠, 等. 自拟解毒利咽方联合布地奈德雾化治疗急性咽炎的疗效以及对Th1/Th2平衡、血清SIgA水平的影响[J]. 中国中医急症, 2021, 30(06): 1016-1019. |
| [13] |
HERICH R. Is the role of IgA in local immunity completely known?[J]. Food and Agricultural Immunology, 2017, 28(2): 223-237. DOI:10.1080/09540105.2016.1258547 |
| [14] |
SUZUKI T, KAWAGUCHI A, AINAI A, et al. Relationship of the quaternary structure of human secretory IgA to neutralization of influenza virus[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 112(25): 7809-7814. |
| [15] |
梁俊薇, 宁云红, 丁爱华. 健脾利咽汤对慢性咽炎患者唾液SIgA水平的影响[J]. 辽宁中医药大学学报, 2012, 14(3): 14-15. |
| [16] |
WADA M, ORIHARA K, KAMAGATA M, et al. Circadian clock-dependent increase in salivary IgA secretion modulated by sympathetic receptor activation in mice[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1): 8802. DOI:10.1038/s41598-017-09438-0 |
| [17] |
徐琳, 袁益静, 刘嘉尹. 喉咽清颗粒对慢性咽炎患者血清炎症反应因子及呼吸道黏膜免疫功能的影响[J]. 慢性病学杂志, 2022, 23(07): 1010-1014. |
| [18] |
张安东, 张新玲. 活血利咽汤治疗慢性咽喉炎疗效及对患者血清SIgA水平影响的研究[J]. 陕西中医, 2018, 39(12): 1771-1774. |
| [19] |
NISHI K, YOSHIMOTO S, NISHI S, et al. Epipharyngeal Abrasive Therapy(EAT) Reduces the mRNA Expression of Major Proinflammatory Cytokine IL-6 in Chronic Epipharyngitis[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(16): 9205. DOI:10.3390/ijms23169205 |
| [20] |
HU Y, LI J, CHANG A K, et al. Potential active constituents responsible for treating acute pharyngitis in the flowers of Hosta plantaginea(Lam.) Aschers and their pharmacokinetics[J]. Food & Function, 2022, 13(6): 3308-3317. |
| [21] |
ZHANG Y P, YUAN T H, LI Y S, et al. Network Pharmacology Analysis of the Mechanisms of Compound Herba Sarcandrae(Fufang Zhongjiefeng) Aerosol in Chronic Pharyngitis Treatment[J]. Drug Design Development And Therapy, 2021, 15: 2783-2803. DOI:10.2147/DDDT.S304708 |
| [22] |
SAMSUZZAMAN M, UDDIN M S, SHAH M A, et al. Natural inhibitors on airway mucin: Molecular insight into the therapeutic potential targeting MUC5AC expression and production[J]. Life Sciences, 2019, 231: 116485. DOI:10.1016/j.lfs.2019.05.041 |
| [23] |
SAJJAN U. Secretory Cells: New Players in Small Airway Mucosal Immunity?[J]. American journal of respiratory cell and molecular biology, 2022, 67(3): 269-270. DOI:10.1165/rcmb.2022-0210ED |
| [24] |
HEWITT R J, LLOYD C M. Regulation of immune responses by the airway epithelial cell landscape[J]. Nature Reviews Immunology, 2021, 21(6): 347-362. DOI:10.1038/s41577-020-00477-9 |
| [25] |
KESIMER M, FORD A A, CEPPE A, et al. Airway Mucin Concentration as a Marker of Chronic Bronchitis[J]. The New England journal of medicine, 2017, 377(10): 911-922. DOI:10.1056/NEJMoa1701632 |
| [26] |
RAJAN D, O'KEEFE E L, TRAVERS C, et al. MUC5AC Levels Associated With Respiratory Syncytial Virus Disease Severity[J]. Clinical infectious diseases, 2018, 67(9): 1441-1444. DOI:10.1093/cid/ciy340 |
| [27] |
CURRAN D R, COHN L. Advances in Mucous Cell Metaplasia A Plug for Mucus as a Therapeutic Focus in Chronic Airway Disease[J]. American Journal of Respiratory Cell And Molecular Biology, 2010, 42(3): 268-275. DOI:10.1165/rcmb.2009-0151TR |
| [28] |
RADICIONI G, CEPPE A, FORD A A, et al. Airway mucin MUC5AC and MUC5B concentrations and the initiation and progression of chronic obstructive pulmonary disease: an analysis of the SPIROMICS cohort[J]. Lancet Respiratory Medicine, 2021, 9(11): 1241-1254. DOI:10.1016/S2213-2600(21)00079-5 |
| [29] |
TANG L, CHEN Q, SUN L, et al. Curcumin suppresses MUC5AC production via interfering with the EGFR signaling pathway[J]. International Journal of Molecular Medicine, 2018, 42(1): 497-504. |
| [30] |
KAKU N, YANAGIHARA K, MORINAGA Y, et al. Immunomodulatory Effect of Linezolid on Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Supernatant-Induced MUC5AC Overexpression in Human Airway Epithelial Cells[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2014, 58(7): 4131-4137. DOI:10.1128/AAC.02811-13 |
| [31] |
SHIRASAKI H, KANAIZUMI E, SEKI N, et al. Leukotriene E4 induces MUC5AC release from human airway epithelial NCI-H292 cells[J]. Allergology International, 2015, 64(2): 169-174. DOI:10.1016/j.alit.2014.11.002 |
| [32] |
YANG X H, WANG S Q, QI L N, et al. An efficient method for qualitation and quantitation of multi-components of the herbal medicine Qingjin Yiqi Granules[J]. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 2023, 227: 115288. DOI:10.1016/j.jpba.2023.115288 |
| [33] |
PANG W T, YANG F W, ZHAO Y B, et al. Qingjin Yiqi granules for post-COVID-19 condition: A randomized clinical trial[J]. Journal of Evidence Based Medicine, 2022, 15(1): 30-38. DOI:10.1111/jebm.12465 |
| [34] |
JIN Z, MA F, CHEN H, et al. Leveraging machine learning to distinguish between bacterial and viral induced pharyngitis using hematological markers: a retrospective cohort study[J]. Scientific Reports, 2023, 13(1): 22899. DOI:10.1038/s41598-023-49925-1 |
| [35] |
DAVIS B B, ZEKI A A, BRATT J M, et al. Simvastatin inhibits smoke-induced airway epithelial injury: implications for COPD therapy[J]. European Respiratory Journal, 2013, 42(2): 350-361. DOI:10.1183/09031936.00042512 |
| [36] |
KLINE M C, KISSLER S M, WHITTLES L K, et al. Spatiotemporal Trends in Group A Streptococcal Pharyngitis in the United States[J]. Clinical Infectious Diseases, 2024, 78(5): 1345-1351. DOI:10.1093/cid/ciae083 |
| [37] |
DE LASTOURS V, MALOSH R, RAMADUGU K, et al. Co-colonization by Streptococcus pneumoniae and Staphylococcus aureus in the throat during acute respiratory illnesses[J]. Epidemiology and infection, 2016, 144(16): 3507-3519. DOI:10.1017/S0950268816001473 |
| [38] |
RAINARD P, FROMAGEAU A, CUNHA P, et al. lipoteichoic acid triggers inflammation in the lactating bovine mammary gland[J]. Veterinary Research, 2008, 39(5): 52. DOI:10.1051/vetres:2008034 |
| [39] |
ANDERSON J, IMRAN S, FROST H R, et al. Immune signature of acute pharyngitis in a Streptococcus pyogenes human challenge trial[J]. Nature communications, 2022, 13(1): 769. DOI:10.1038/s41467-022-28335-3 |
| [40] |
CHRISTENSEN D, MORTENSEN R, ROSENKRANDS I, et al. Vaccine-induced Th17 cells are established as resident memory cells in the lung and promote local IgA responses[J]. Mucosal Immunology, 2017, 10(1): 260-270. DOI:10.1038/mi.2016.28 |
| [41] |
TURULA H, WOBUS C E. The Role of the Polymeric Immunoglobulin Receptor and Secretory Immunoglobulins during Mucosal Infection and Immunity[J]. Viruses-Basel, 2018, 10(5): 237. DOI:10.3390/v10050237 |
| [42] |
VAN DALEN R, ELSHERBINI A M A, HARMS M, et al. Secretory IgA impacts the microbiota density in the human nose[J]. Microbiome, 2023, 11(1): 233. DOI:10.1186/s40168-023-01675-y |
| [43] |
PLAT-SINNIGE M J T, VERKAIK N J, VAN WAMEL W J B, et al. Induction of Staphylococcus aureus-specific IgA and agglutination potency in milk of cows by mucosal immunization[J]. Vaccine, 2009, 27(30): 4001-4009. DOI:10.1016/j.vaccine.2009.04.034 |
| [44] |
NAGASAWA Y, KIKU Y, SUGAWARA K, et al. Staphylococcus aureus-specific IgA antibody in milk suppresses the multiplication of S. aureus in infected bovine udder[J]. BMC Veterinary Research, 15(1): 286. DOI:10.1186/s12917-019-2025-3 |
| [45] |
XU M, HU T Y, LI D C, et al. Yan-Hou-Qing formula attenuates ammonia-induced acute pharyngitis in rats via inhibition of NF-κB and COX-2[J]. BMC Complementary Medicine And Therapies, 2020, 20(1): 280. DOI:10.1186/s12906-020-03077-1 |
| [46] |
RABY K L, MICHAELOUDES C, TONKIN J, et al. Mechanisms of airway epithelial injury and abnormal repair in asthma and COPD[J]. Frontiers in Immunology, 2023, 14: 1201658. DOI:10.3389/fimmu.2023.1201658 |
| [47] |
PENG Y, WANG Z N, XU A R, et al. Mucus Hypersecretion and Ciliary Impairment in Conducting Airway Contribute to Alveolar Mucus Plugging in Idiopathic Pulmonary Fibrosis[J]. Frontiers in Cell And Developmental Biology, 2022, 9: 810842. DOI:10.3389/fcell.2021.810842 |
| [48] |
FAHY J V, DICKEY B F. Airway mucus function and dysfunction[J]. New England Journal of Medicine, 2010, 363(23): 2233-2247. DOI:10.1056/NEJMra0910061 |
| [49] |
SINGANAYAGAM A, FOOTITT J, MARCZYNSKI M, et al. Airway mucins promote immunopathology in virus-exacerbated chronic obstructive pulmonary disease[J]. Journal of Clinical Investigation, 2022, 132(8): e120901. DOI:10.1172/JCI120901 |
| [50] |
MANEVSKI M, DEVADOSS D, LONG C S P, et al. Increased Expression of LASI lncRNA Regulates the Cigarette Smoke and COPD Associated Airway Inflammation and Mucous Cell Hyperplasia[J]. Frontiers in Immunology, 13: 803362. DOI:10.3389/fimmu.2022.803362 |
| [51] |
JACKSON D, FLYNN K, ROSASCO M, et al. The Influence of MUC5AC SNPs on expression of MUC5AC and mucus hypersecretion genes during asthma exacerbations[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2020, 145(2). |
| [52] |
田盈, 张硕, 郑文科, 等. 清金益气颗粒治疗新型冠状病毒奥密克戎变种毒株感染者恢复期低热验案1则[J]. 天津中医药, 2022, 39(6): 692-696. |
| [53] |
LIU M, YANG J, QIAN S, et al. Mahuang Xixin Fuzi decoction protects the BALB/c-nude mice infected with influenza A virus by reducing inflammatory cytokines storm and weakly regulating SIgA immune response[J]. Journal of ethnopharmacology, 2023, 304: 116070. DOI:10.1016/j.jep.2022.116070 |
| [54] |
KRISMER B, LIEBEKE M, JANEK D, et al. Nutrient limitation governs Staphylococcus aureus metabolism and niche adaptation in the human nose[J]. PLoS pathogens, 2014, 10(1): e1003862. DOI:10.1371/journal.ppat.1003862 |