2025, Vol. 44文章信息
- 石婷婷, 耿潇, 李梦瑶, 白雨欣, 王虹
- SHI Tingting, GENG Xiao, LI Mengyao, BAI Yuxin, WANG Hong
- 脑心通胶囊抗心肌梗死的血清蛋白质组学研究
- Serum proteomics study of Naoxintong Capsule against myocardial infarction
- 天津中医药大学学报, 2025, 44(12): 1091-1102
- Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2025, 44(12): 1091-1102
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2025.12.06
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文章历史
收稿日期: 2025-07-09
2. 天津中医药大学测试中心, 天津 301617
2. Instrumental Analysis and Research Center, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China
心血管疾病（CVDs）以心肌缺血性损伤及出血性病理改变为主要特征，尤其是由急性心肌梗死（AMI）引起的充血性心力衰竭和恶性心律失常，是导致高死亡率的核心因素。据统计，中国CVDs患者人数已达3.3亿，且AMI发病呈现显著年轻化趋势[1]。CVDs的发生发展是一个多变量、多因素相互作用的多维过程，涉及炎症反应、氧化应激及代谢紊乱等多通路交互作用[2]。尽管现有的治疗手段可通过靶向特定病理环节改善短期预后，但难以做到标本兼治的特异性综合治疗。因此，通过多靶点协同调控实现病理进程阻断，已成为突破当前治疗瓶颈的关键方向[3]。
中药复方凭借“多成分-多靶点-多通路”协同作用特点，在复杂疾病治疗中展现出了独特优势。脑心通胶囊源于补阳还五汤，由黄芪、赤芍、丹参等16味中药组成，具有活血化瘀、行气止痛的功效。近年研究证实，该方可以通过调节炎症[4]、改善凝血[5]和促进血管生成[6]来减少心肌损伤并改善心脏功能，已广泛应用于缺血性CVDs和脑血管疾病的临床治疗和二级预防[7]。临床研究显示脑心通胶囊联合常规西药在心肌梗死（MI）治疗中可提高总有效率至85.9%[8]，并显著改善左心室射血分数（LVEF）和氨基末端脑利肽前体（NT-proBNP）水平[9]。然而，其作用机制和分子靶点尚未完全阐明，严重制约了质量标志物发现与精准用药方案的制定。
蛋白质组学技术的快速发展为解析中药多靶点作用机制提供了新契机。相较于转录组学与代谢组学，蛋白质组学能更直接反映功能蛋白的动态变化，且具有更高的病理表型相关性[10]。特别是血清蛋白质组学，因其非侵入性采样优势及对微环境变化的敏感性，已成为发现疾病诊断标志物和药物作用靶标的重要平台[11]。近年研究表明，心肌缺血可诱导血清中血管生成抑制因子[如血管生成抑制蛋白1（Vash1）][12]、线粒体功能调控蛋白[如线粒体融合蛋白1（Mfn1）][13]及基质重塑相关酶[如组织金属蛋白酶抑制剂3（Timp3）/基质金属蛋白酶9（MMP9）][14]的异常表达，这些蛋白网络的变化与心室重构进程密切相关。通过高通量筛选技术系统分析中药干预后的血清蛋白表达谱，有望揭示其多维度调控机制。
研究整合双向凝胶电泳（2-DE）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）及蛋白质芯片技术，系统分析脑心通胶囊干预后MI小鼠血清差异表达蛋白（DEPs）。通过生物信息学筛选关键调控靶点，并采用蛋白免疫印迹（Western blot）法验证其在心、脑组织的表达模式，旨在揭示脑心通胶囊多靶点作用网络，为优化临床用药方案提供科学依据。
1 实验材料 1.1 药品与试剂脑心通胶囊（批准文号：国药准字Z20025001）内容物粉末，陕西步长制药有限公司；TTC溶液（2，3，5-氯化三苯基四氮唑，60508ES25），上海翌圣生物科技股份有限公司；多聚甲醛，科密欧公司；苏木精-伊红（HE）染色液（C0105）购自上海碧云天生物技术有限公司；原位细胞死亡检测试剂盒（11684795910）购自Roche（上海）；Anti-Caspase-3 antibody（9662S）购自cell signal（美国）；Anti-TNF alpha antibody（ab1793），Anti-Fas Ligand antibody（ab186671）购自Abcam（Cambridge，UK）；Goat anti-Mouse IgG（H+L）Alexa Fluor® 488 conjugate（A28175）、Goat anti-Rabbit IgG（H+L）Alexa Fluor® 594 conjugate（SA000046），赛默飞世尔科技公司；IPG预制胶条（1632008，pH=4-7，17cm），BIO-RAD公司（MN，美国）；考马斯亮蓝R-250（6104-59-2）美国Solarbio公司；全蛋白提取试剂盒，上海生工；Proteo ExtractTM Albumin/IgG Removal Kit（122643），Maxi Merck；BCA Protein Assay Kit（7780）购自Cell Signaling Technology，Inc.（细胞信号技术公司）；PageRulerTM Prestained Protein Ladder（货号：26617），购自赛默飞世尔科技公司；Anti-Timp 3 antibody（ab277794）、Anti-Ghrhr antibody（ab187512）、Anti-eNOS（ab300071）、Anti-p-eNOS antibody（ab215717）、Anti-VEGFA antibody（ab46154）、Anti-Albumin antibody（ab207327）购自Abcam Plc；Anti-MMP 9 antibody（30592-1-AP）、Anti-Mfn 1 antibody（66776-1-Ig）、Anti-Gpd 1 antibody（13451-1-AP），Proteintech集团（Proteintech Group，Inc.）；Anti-β-actin antibody（4970S）、Anti-α-tubulin antibody（2125S）、Anti-Akt antibody（9272S）、Anti-p-Akt antibody（4060S），Cell Signaling Technology，Inc.（细胞信号技术公司）；Anti-Vash 1 antibody（PA5-102039），赛默飞世尔科技公司；Proteome Profiler Mouse Angiogenesis Array Kit（ARY015）购自Roche（上海）；PE Rat IgG2ak Isotype Control（553930）由BD（美国）提供；Mouse/Rat PDGF-BB Quantikine ELISA Kit（MBB00）由R&D systems（美国）提供。
1.2 实验仪器Amicon Ultra离心超滤管，美国Millipore公司；TRANS-BLOT® SD PROTEANⅡxi Cell电泳槽，Mini-PROTEAN® Tetra System电泳槽，PROTEAN IEF Cell等点聚焦系统，ChemiDoc MP成像系统，EXQuestTM Spot Cutter切胶仪均为美国BIO-RAD公司；ZD-9556A脱色摇床，江苏盛蓝仪器制造有限公司；800型激光辅助解析串联质谱，ABI公司；GENE GENIUS凝胶成像分析仪，美国Syngene公司；Flex Station 3多功能酶标仪，美国Molecula Device公司；Harvard USA ventilators687小动物呼吸机，美国Harvard Inspira公司；ECLIPSE TE300正置式生物显微镜，日本Nikon公司；BMJ-1生物组织包埋机，上海珂淮仪器有限公司；ECLIPSE TS100倒置显微镜，日本Nikon公司。
1.3 实验动物SPF级C57BL/6小鼠30只（雌雄各半，8周龄，体质量（25.0±1.0）g，动物生产许可证号：SCXK（京）2012-0001，北京维通利华实验动物技术有限公司）。实验操作符合天津中医药大学实验动物伦理委员会审批要求（TCM-LAEC2023205s1803），饲养环境：温度22~25 ℃，相对湿度（40%~60%），12 h昼夜循环，自由摄食饮水。
2 实验方法 2.1 MI模型构建采用左前降支冠状动脉永久性结扎法建立MI模型。麻醉：腹腔注射Avertin（2.5%溶液，0.33 mL/20 g）；气管插管：小鼠采取仰卧位固定于手术台上，碘酒消毒颈部及胸部进行备皮。颈部正中切口暴露气管，进行气管插管，导管连接小动物的呼吸机；开胸结扎：左侧第4肋间开胸，暴露心脏，于心尖距左心耳1/3~1/2处采用8-0单丝尼龙缝合线进行永久性结扎，结扎后可见结扎点以下出现苍白缺血区；术后管理：逐层缝合胸腔，术后将小鼠置于37 ℃恒温加热垫维持体温，苏醒后放回清洁笼。
2.2 给药方案分组：将30只小鼠随机分为假手术组（仅开胸不结扎）、模型组、脑心通组，每组10只。脑心通混悬液配制：精密称取脑心通粉末，以生理盐水配制成70 mg/mL混悬液。脑心通组给予300 mg/（kg·d）灌胃，模型组与假手术组给等体积生理盐水，连续干预3 d。根据《中国药典》成人日剂量（2.4 g/70 kg），按体表面积等效剂量换算为小鼠300 mg/（kg·d）（公式：小鼠剂量=人剂量×9.01）。给药周期参考AMI早期干预窗口[15]（72 h内病理改变显著）。
2.3 样本采集处理血清制备：取血前12 h禁食不禁水，末次给药后1 h，经心尖穿刺采血，室温静置30 min后，3 000 r/min离心15 min，离心半径10 cm，取上清转移，7 500 r/min再次离心15 min，上清即为分离出的血清。新鲜血清立即去除高丰度蛋白质转移至超滤管中，4 000 r/min离心1 h，对其进行除盐和浓缩，得到最终的去除高丰度蛋白的血清样品，BCA法检测浓度，并将其冻存于-80 ℃。
组织处理：4%多聚甲醛灌注固定心脏组织，石蜡包埋后切片（厚度4 μm）；取部分心肌组织液氮速冻保存于-80 ℃超低温冰箱。
2.4 检测方法 2.4.1 HE染色石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，苏木精染色5 min，伊红染色2 min，中性树脂封片，显微镜下观察心肌病理改变；
2.4.2 TUNEL染色采用原位细胞死亡检测试剂盒，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染细胞核，使用倒置荧光显微镜拍照观察。
2.4.3 免疫荧光染色石蜡切片60 ℃烘烤4 h，经乙醇梯度脱蜡与水化后进行抗原修复。5%牛血清白蛋白（BSA）封闭45 min后，4 ℃过夜孵育一抗，PBS漂洗后，二抗室温避光孵育1 h。DAPI复染细胞核，使用倒置荧光显微镜拍照观察。
2.4.4 氯化三苯四氮唑（TTC）染色术后3 d取心脏组织，-20 ℃速冻后连续切片（厚度1 mm），2% TTC溶液（pH 7.4）37 ℃避光染色15 min。正常心肌组织呈砖红色，梗死区呈苍白色。
2.4.5 2-DE取2 mg血清蛋白样品加入水化上样缓冲液中至溶液总体积为320 μL，采用pH 4-7 IPG预制胶条进行等电聚焦（程序设置：50 V-12 h，250 V-1 h，1 000 V- 30 min，5 000 V-1 h，8 000 V-1 h，1 000 V-30 min）。等电聚焦完毕后，分别加入胶条平衡缓冲液Ⅰ和Ⅱ，摇晃15 min。配置10% SDS-PAGE进行垂直电泳，80 V-30 min，300 V-4 h条件下电泳至底部。完成后进行染色脱色，扫描凝胶图谱。
2.4.6 质谱鉴定考马斯亮蓝染色后EXQuestTM Spot Cutter切取DEPs点，MALDI-TOF-MS（AB Sciex 5800）分析，利用Mascot软件进行数据库检索。
2.4.7 DEPs筛选DEPs筛选标准如下：显著性阈值：P < 0.05；差异倍数：|fold change|≥2；质谱可信度：Mascot评分≥60。
2.4.8 Western blot在含破碎组织的离心管中加入与质量对应的裂解液，在冰上进行组织匀浆化，于14 000 g，4 ℃条件下离心5 min，取上清，即为所提取的组织蛋白样品。BCA法检测蛋白样品浓度。蛋白样品经10%尿蛋白圆盘电泳（SDS-PAGE）分离，转膜后用5%脱脂牛奶封闭3 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，在暗室中曝光，用凝胶成像分析仪扫描电泳条带。
2.4.9 蛋白质芯片采用Proteome Profiler Mouse Angiogenesis Array Kit，按说明书操作，ChemiDoc MP成像系统采集信号。
2.5 统计学方法使用SPSS软件进行统计学处理。结果以均数±标准差（x±s）表示。若方差齐，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结果 3.1 脑心通改善心肌组织病理损伤采用TTC染色法对MI术后3 d小鼠心肌组织进行染色，观察缺血部位。TTC染色结果显示，假手术组正常心肌组织全部呈红色，未见白色梗死区域，说明心肌正常；与假手术组相比，模型组与脑心通组两组，心肌组织出现明显白色区域，缺血组织明显，表明MI模型建立成功。术后3 d采集心肌组织，经固定后进行HE染色，染色结果显示，假手术组心肌细胞的形态和结构正常，心肌纤维排列整齐；模型组心肌细胞水肿，心肌纤维排列紊乱，伴炎性浸润。与模型组相比，脑心通干预显著减轻上述病理改变。采用TUNEL法和免疫荧光法检测MI后28 d小鼠心肌组织的细胞凋亡和细胞凋亡相关信号蛋白的表达。结果发现，与模型组相比，脑心通组的TUNEL+（红色）、Fas+（红色）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）+（绿色）信号减少。这些结果表明，脑心通可通过减少细胞凋亡改善心肌组织病理损伤。见图 1。
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| 注：图A，TTC染色对比图；图B，心肌组织HE染色（×200）；图C，凋亡细胞经TUNEL染色（红色）、Caspase3染色（红色）和Fas染色（红色），细胞核经DAPI染色（蓝色）（×400）。TNF-α染色（绿色），细胞核经DAPI染色（蓝色）（比例尺100 μm，n=6）。 图 1 脑心通对MI小鼠心肌组织病理及凋亡的影响 |
为研究脑心通治疗MI的机制，采用2-DE分析血清中蛋白质的表达。3个平行实验的2-DE像显示出良好的重复性。图像的右下角是低丰度蛋白点的主要分布区。没有明显的水平和垂直条纹。蛋白点清晰可见，数量较多，有利于分析DEPs。使用PDQuestTM2-D Analysis软件分析2-DE图像，Mascot搜索DEPs。其中90个蛋白在模型组表达下调而脑心通组上调（Fold Change > 2，P < 0.05），10个蛋白呈现相反趋势，通过热图可视化分析血清DEPs表达模式。应用PATHER对DEPs进行分类，涉及的信号通路主要包括细胞凋亡信号通路、EGF受体信号通路、FAS信号通路、促性腺激素释放激素受体途径、炎症介导的趋化因子和细胞因子信号途径、白介素信号途径以及促甲状腺激素释放激素受体信号通路等。这些通路可能参与了脑心通发挥药效的过程。为了进一步探讨脑心通对心肌缺血的作用机制，对图中的几种蛋白质的表达进一步研究。见图 2。
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| 注：图A，2-DE图谱（n=3）；图B，应用PATHER将DEPs分类归纳；图C，脑心通干预后血清DEPs表达热图。 图 2 脑心通胶囊干预后血清DEPs筛选 |
Gpd1是图 2C中的蛋白质之一，是糖脂代谢的关键酶，催化甘油-3-磷酸转化为磷酸二羟丙酮[16]，维持心肌能量稳态。2-DE图像（图 3A）显示，Gpd1蛋白点清晰，位于低丰度蛋白区；灰度值分析显示，与假手术组相比，模型组Gpd1的表达水平显著下降；与模型组相比，脑心通组Gpd1的表达水平显著上升。Western blot检测小鼠血清、心脏和脑组织中Gpd1的表达。模型组小鼠血清中Gpd1的表达明显降低，而脑心通组则明显升高（图 3B），与2-DE的结果一致。在心脏和脑组织中，Gpd1的表达水平呈相同趋势，但无统计学意义。这些结果表明，脑心通可能通过调控Gpd1表达水平影响细胞代谢。
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| 注：图A，通过2-DE电泳分析小鼠Gpd1蛋白的位置；图B，Western blot法检测小鼠血清、心脏及脑组织中Gpd1蛋白的表达水平。与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。 图 3 脑心通胶囊调控Gpd1蛋白表达（x±s，n=3） |
研究表明，生长激素释放激素（GHRH）及其激动剂对心脏功能和重塑有良好的影响[17]，如减少心肌细胞凋亡和防止缺血/再灌注损伤。2-DE结果显示模型组Ghrhr的表达水平明显低于假手术组，但用脑心通治疗可增加Ghrhr的表达（图 4A）。Western blot检测3组小鼠血清、心脏和脑组织中Ghrhr的表达。结果与2-DE凝胶电泳结果相似，但3组组织中的差异无统计学意义（图 4B）。因此推测，脑心通可以提高Ghrhr的水平，放大GHRH对心脏重塑的作用。
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| 注：图A，通过2-DE凝胶电泳分析小鼠Ghrhr蛋白的位置；图B，Western blot法检测小鼠血清、心脏及脑组织中Ghrhr蛋白的表达水平。 图 4 脑心通对MI小鼠Ghrhr表达的影响（x±s，n=3） |
Timp3是基质金属蛋白酶（MMPs）的抑制剂，在CVDs中发挥着重要作用。Timp3通过与血管内皮生长因子（VEGF）受体2直接相互作用发挥抗血管生成作用，从而导致MI后心室重构不良和心功能不全[18]。2-DE结果显示（图 5A），Timp3蛋白点相对清晰，处于低丰度蛋白区。与假手术组相比，模型组的Timp3表达下降，而在脑心通处理后Timp3的表达有所增加。用Western blot检测3组小鼠血清、心脏和脑组织中的Timp3。模型组小鼠血清和心脏中Timp3的表达量显著下降，而脑心通组小鼠血清和心脏中Timp3的表达量显著回升（图 5B）；小鼠脑组织中Timp3的表达量也有同样的趋势，但差异无统计学意义。有证据表明，Timp3通过抑制MMP9活性稳定ECM，延缓心室重构。MMP9是Timp3的重要底物，可损害血管生成和心脏重塑[18-19]。用Western blot检测3组小鼠心脏组织中的MMP9，发现连续给药3 d后，模型组MMP9的表达显著增加，而脑心通组则显著减少（图 5C）。
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| 注：图A，Timp3蛋白的位置。图B，Timp3蛋白的表达水平，与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。图C，MMP9蛋白的表达水平，与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。 图 5 脑心通对MI小鼠Timp3/MMP-9蛋白表达的影响（x±s，n=3） |
为了进一步探讨能信通调控细胞代谢的机制，笔者检测了Mfn1的表达。Mfn1促进线粒体融合，维持线粒体功能，被认为与多种CVDs相关[20]。从2-DE图像（图 6A）中可以看出，Mfn1蛋白点清晰，处于低丰度蛋白区。灰度值分析表明，模型组Mfn1蛋白表达水平明显低于假手术组，脑心通干预组恢复Mfn1蛋白表达水平。采用Western blot进一步明确Mfn1在相同分组和处理的不同组织中的表达水平。与2-DE的结果一致，在血清样本中也有同样的统计学差异。在心脏组织中，模型组的Mfn1表达量低于假手术组，但差异无统计学意义，但脑心通组的Mfn1表达量明显增加（图 6B）。在小鼠脑组织中，Mfn1的表达也有相同的趋势，但差异无统计学意义。有研究表明，Mfn1可激活Akt和eNOS通路，促进血管生成[21]。结果显示，与假手术组相比，模型组小鼠心脏中p-eNOS/eNOS的比值显著升高（图 6C），p-Akt/Akt的比值也升高，但差异无统计学意义。与模型组相比，脑心通组小鼠心脏中p-Akt/Akt的比值明显增加（图 6C），p-eNOS/eNOS的比值增加，但差异无统计学意义。
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| 注：图A，Mfn1蛋白的位置。图B，Mfn1蛋白的表达水平，与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05。图C，Akt和eNOS蛋白的表达水平，与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。 图 6 脑心通对Mfn1-Akt/eNOS通路蛋白表达的影响（x±s，n=3） |
Vash1是血管内皮细胞产生的内源性血管生成抑制因子，通过拮抗VEGF信号抑制病理性血管渗漏，在病理性血管生成的疾病中，Vash 1的表达明显上升[22]。Western blot检测了MI小鼠血清、心脏和脑组织中Vash1的含量变化。结果显示，模型组血清中Vash1的含量显著增加，而脑心通组血清中Vash1的含量显著减少（图 7）。而在心脏和脑组织中，Vash1的表达趋势相同，差异无统计学意义。这些结果表明，Vash1表达变化提示其可能参与脑心通促血管生成效应。
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| 注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。 图 7 脑心通对MI小鼠Vash1蛋白表达的影响（x±s，n=3） |
采用Proteome Profiler血管生成抗体蛋白芯片技术检测发现（图 8A），与生理盐水模型组相比，小鼠在MI后饲喂脑心通时，大部分蛋白的表达都出现了下调（图 8B）。血小板衍生生长因子（PDGF）和碱性成纤维细胞生长因子（FGF basic）的表达在脑心通组显著增加（图 8B），提示脑心通可能具有选择性激活促血管生成信号的能力。用酶联免疫吸附（ELISA）法检测MI后7、14和28 d血清中PDGF-BB的表达。结果显示，在MI后7 d和28 d，脑心通组血清中血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）的表达明显增加（图 8C）。
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| 注：图A，采用蛋白芯片分析血清中指示的血管生成因子。图B，脑心通组中PDGF的表达，与模型组比较，**P＜0.01（n=6）。图C，血清中PDGF-BB的水平，与模型组比较，*P＜0.05（n=5）。 图 8 脑心通对MI小鼠血管生成相关蛋白表达的调控作用（x±s） |
CVDs作为以“四高一多”（高发病率、高病死率、高致残率、高复发率及多并发症）为特征的复杂病理体系[23-24]，在发展过程中，体内许多蛋白质发生了变化并产生了复杂的相互作用。脑心通胶囊在MI治疗中展现多维机制，其通过调控缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）/血管内皮生长因子（VEGF）通路[6]和炎症反应[降低白细胞介素（IL）-6）][25]减轻血栓形成及心肌损伤；同时促进一氧化氮（NO）释放，改善内皮功能[26]，抑制左室重构。此外，动物实验证实其通过激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt通路[27]，减轻氧化损伤。本研究基于血清蛋白质组学技术，结合分子生物学验证，系统阐明了脑心通胶囊通过多靶点协同作用改善MI病理进程的机制，为中药复方“多成分-多靶点-多通路”作用模式提供了实验依据，凸显其在CVDs治疗中的独特优势。
4.1 脑心通调控血管生成与基质重塑的双向效应Vash1作为内皮源性血管生成抑制因子，已被证实可有效抑制血管内皮细胞增殖及血管网络形态发生[28]。机制研究进一步揭示，该蛋白在体内通过负向调控血管内皮生长因子VEGF信号传导，发挥拮抗血管新生效应[29]。本研究蛋白质组学分析发现，脑心通可抑制血管生成负调控因子Vash1，同时蛋白芯片技术检测发现脑心通可显著上调促血管生成因子PDGF-BB。
Timp3作为MMPs家族特异性内源抑制因子[30]，对MMP9活性具有显著拮抗作用，其病理生理学调控功能在CVDs进程中至关重要[31]。Timp3通过抑制MMP9活性维持细胞外基质（ECM）稳定性，其表达下降导致ECM过度降解，左心室壁变薄，促进心室重构[32]。脑心通上调Timp3可能通过抑制MMP9介导的胶原降解，减少瘢痕扩张。Timp3通过直接与VEGF受体2相互作用发挥其抗血管生成效应，从而抑制心脏重塑和功能障碍。进一步研究发现，脑心通通过激活Timp3/MMP9轴，使心肌组织MMP9活性降低，而Timp3表达增加，提示其通过双重机制（促进新生血管形成+抑制基质过度降解）改善心肌微环境，与补阳还五汤“益气活血”的经典功效相呼应。
4.2 线粒体稳态与能量代谢的重编程作用在线粒体结构与功能完整性对CVDs发生发展的调控机制中，Mfn1作为定位于线粒体外膜，已被证实是介导线粒体融合动力学过程的关键调节因子，在调节线粒体融合和维持线粒体稳态及形态中起着重要作用。Mfn1表达上调可有效抑制线粒体裂变过程及后续细胞死亡通路激活，而Mfn1的抑制则会促进细胞凋亡[33]。此外，现有证据表明Mfn1通过协同激活PI3K/Akt/eNOS信号轴发挥促血管生成作用[21]。本研究发现，脑心通可上调Mfn1表达，显著增加p-Akt/Akt比值。这些研究结果提示，脑心通的心脏保护作用机制可能涉及增强Mfn1依赖性信号通路，特别是通过协同调节Akt与eNOS磷酸化状态而实现。这与黄芪、丹参等君药成分的抗氧化及能量代谢调节作用密切相关，为“益气养阴”治则提供了现代科学阐释。
脑心通显著逆转Gpd1表达下调，提示其通过恢复甘油-3-磷酸代谢通路减少脂毒性损伤。研究表明，Gpd1缺失可导致心肌细胞内三酰甘油累积，诱发线粒体氧化应激和三磷酸腺苷（ATP）合成障碍[34-35]。结合丹玉通脉颗粒调控支链氨基酸代谢的机制[34]，脑心通可能通过协同调节糖脂代谢与炎症小体活性（如抑制NLRP3），阻断代谢-炎症恶性循环，从而改善心肌能量供应并减少凋亡。
4.3 多靶点抗凋亡机制Ghrhr在心肌细胞[36]和成纤维细胞[37]的细胞膜上存在，并介导GHRH的直接效应。研究表明，GHRH能促进心肌细胞的存活，并保护离体大鼠心脏免受缺血/再灌注损伤[38]；Ghrhr激活后可以通过PI3K/Akt通路抑制线粒体凋亡途径，MI后Ghrhr表达下降可能导致Akt磷酸化水平降低，促凋亡蛋白（如Bax）活化，加剧心肌细胞死亡[39-40]。通过GHRH激动剂激活心脏中的Ghrhr可能通过调节细胞凋亡途径减少MI后的炎症反应，从而改善心脏的愈合和重构。本研究发现，脑心通可上调Ghrhr表达，同时，脑心通显著抑制心肌细胞凋亡关键蛋白Caspase-3活化。这些结果表明，脑心通可能通过多靶点抗凋亡减少心肌细胞凋亡来保护心脏功能。
以上结果表明脑心通通过多种机制发挥其心脏保护作用，包括调控血管生成与基质重塑，线粒体稳态，以及细胞凋亡相关的信号通路。这些发现为脑心通作为CVDs的潜在治疗药物提供了科学依据，并指出了可能的作用靶点和机制。但本文仍存在一定的局限性：本研究聚焦AMI早期（72 h内）的病理机制，未能反映脑心通胶囊在MI长期治疗中的作用，未来在后续工作中延长给药周期（4周），结合心脏超声、组织纤维化染色（如马松染色）及长期生存率分析，系统评估脑心通对心室重构的远期影响；研究通过TTC染色确认MI面积，但未检测心脏功能指标（如超声心动图）及心肌酶谱变化，未来需结合多维度数据完善模型评估；对于脑心通活性成分与靶蛋白的直接互作机制尚未解析，未来的研究将进一步探索脑心通在CVDs治疗中的具体应用和效果。
5 结论本研究基于血清蛋白质组学，结合双向凝胶电泳、质谱分析及分子生物学验证方法，系统探究了脑心通胶囊抗心肌梗死的作用机制与分子靶点。脑心通胶囊可显著缩小心肌梗死小鼠左心室梗死面积，减轻心肌细胞水肿与炎性浸润。其通过下调Caspase-3、Fas及TNF-α等凋亡相关蛋白表达，降低心肌细胞凋亡率，改善心肌病理损伤。血清蛋白质组学筛选得到100个差异表达蛋白，主要涉及血管生成、基质重塑、线粒体功能及能量代谢等信号通路，其中Vash1、Gpd1、Timp3、Mfn1等关键蛋白的异常表达经干预后显著逆转。脑心通协同调控Vash1/PDGF-BB介导的血管生成、Timp3/MMP9主导的基质重塑及Mfn1依赖的线粒体动力学发挥心肌保护效应，为其临床治疗缺血性心血管疾病提供机制支撑，也为中药复方多靶点机制解析建立"蛋白质组学筛选- 靶点验证- 通路构建" 研究策略，后续将进一步聚焦核心活性成分与靶蛋白相互作用，识别多活性成分并构建新型多组分药物。
| [1] |
刘明波, 何新叶, 杨晓红, 等. 《中国心血管健康与疾病报告2023》要点解读[J]. 中国心血管杂志, 2024, 29(4): 305-324. |
| [2] |
LIBBY P. The changing landscape of atherosclerosis[J]. Nature, 2021, 592(7855): 524-533. DOI:10.1038/s41586-021-03392-8 |
| [3] |
ARNETT D K, BLUMENTHAL R S, ALBERT M A, et al. 2019 ACC/AHA guideline on the primary prevention of cardiovascular disease: Executive summary: A report of the American college of cardiology/American heart association task force on clinical practice guidelines[J]. Circulation, 2019, 140(11): e563-e595. |
| [4] |
尚津锋, 焦家康, 路颖慧, 等. 脑心通胶囊"心脑同治"的免疫和炎症标志物研究[J]. 中草药, 2024, 55(6): 2013-2026. |
| [5] |
邵延萱, 黄展, 张淑萍. 脑心通联合降纤酶治疗急性脑血栓的疗效及对血液流变学和凝血功能的改善[J]. 黑龙江医药科学, 2022, 45(1): 66-67, 69. |
| [6] |
张晓璐, 尚津锋, 文胤琏, 等. 基于HIF-1α/VEGF通路脑心通胶囊治疗多发性脑梗死模型大鼠并发心肌损伤的作用机制研究[J]. 中国中药杂志, 2025, 50(7): 1889-1899. |
| [7] |
李伟霞, 张书琦, 赵艺丹, 等. 脑心通胶囊化学成分、药理作用及临床应用研究进展[J]. 中国中药杂志, 2018, 43(10): 1998-2005. |
| [8] |
杨俊林, 李海军. 脑心通胶囊治疗急性脑梗死的效果观察[J]. 中国当代医药, 2014, 21(24): 93-95. |
| [9] |
郭淑惠, 路金玲, 肖玉凤, 等. 步长脑心通胶囊对心肌梗塞患者血清脂联素、NT-proBNP及心功能的影响[J]. 中华中医药学刊, 2017, 35(6): 1545-1548. |
| [10] |
SUO T C, WANG H X, LI Z. Application of proteomics in research on traditional Chinese medicine[J]. Expert Review of Proteomics, 2016, 13(9): 873-881. DOI:10.1080/14789450.2016.1220837 |
| [11] |
ZHU Y Y. Plasma/serum proteomics based on mass spectrometry[J]. Protein and Peptide Letters, 2024, 31(3): 192-208. DOI:10.2174/0109298665286952240212053723 |
| [12] |
WANG W M, SHANG W T, ZOU J, et al. ZNF667 facilitates angiogenesis after myocardial ischemia through transcriptional regulation of VASH1 and Wnt signaling pathway[J]. International Journal of Molecular Medicine, 2022, 50(4). DOI:10.3892/ijmm.2022.5185 |
| [13] |
TOKUYAMA T, YANAGI S. Role of mitochondrial dynamics in heart diseases[J]. Genes, 2023, 14(10): 1876. DOI:10.3390/genes14101876 |
| [14] |
NAKANO S J, SIOMOS A K, GARCIA A M, et al. Fibrosis-related gene expression in single ventricle heart disease[J]. The Journal of Pediatrics, 2017, 191: 82-90.e2. DOI:10.1016/j.jpeds.2017.08.055 |
| [15] |
FISHBEIN M C, MEERBAUM S, RIT J, et al. Early phase acute myocardial infarct size quantification: Validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique[J]. American Heart Journal, 1981, 101(5): 593-600. DOI:10.1016/0002-8703(81)90226-X |
| [16] |
OH S, MAI X L, KIM J, et al. Glycerol 3-phosphate dehydrogenases(1 and 2) in cancer and other diseases[J]. Experimental & Molecular Medicine, 2024, 56(5): 1066-1079. |
| [17] |
YU H, PENG H. Effects of GHRH and its analogues on the vascular system[J]. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders, 2025, 26(3): 493-505. DOI:10.1007/s11154-024-09932-7 |
| [18] |
FAN D, KASSIRI Z. Biology of tissue inhibitor of metalloproteinase 3(TIMP3), and its therapeutic implications in cardiovascular pathology[J]. Frontiers in Physiology, 2020, 11: 661. DOI:10.3389/fphys.2020.00661 |
| [19] |
CABRAL-PACHECO G A, GARZA-VELOZ I, CASTRUITA-DE LA ROSA C, et al. The roles of matrix metalloproteinases and their inhibitors in human diseases[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2020, 21(24): 9739. DOI:10.3390/ijms21249739 |
| [20] |
LIN J G, DUAN J L, WANG Q Q, et al. Mitochondrial dynamics and mitophagy in cardiometabolic disease[J]. Frontiers in Cardiovascular Medicine, 2022, 9: 917135. DOI:10.3389/fcvm.2022.917135 |
| [21] |
ZHOU Q, GENSCH C, KELLER C, et al. MnTBAP stimulates angiogenic functions in endothelial cells through mitofusin-1[J]. Vascular Pharmacology, 2015, 72: 163-171. DOI:10.1016/j.vph.2015.05.007 |
| [22] |
STRZELCZYK J, WÓJCIK-GIERTUGA M, CUBER P, et al. Assessment of the concentration of endogenous factors regulating angiogenesis, VASH-1 and VEGF-A, in the blood serum of patients with neuroendocrine neoplasms[J]. Bio Med Research International, 2022, 2022: 9084393. |
| [23] |
林建军. 心脑血管疾病防治方法研究[J]. 中外医疗, 2009, 28(26): 168, 170. |
| [24] |
PUTAALA J. Ischemic stroke in young adults[J]. Continuum, 2020, 26(2): 386-414. DOI:10.1212/CON.0000000000000833 |
| [25] |
张亚兵, 邓阿黎, 叶太生, 等. 脑心通对稳定型心绞痛患者血清hs-CRP、IL-6和TNF-α的影响[J]. 中国药师, 2011, 14(9): 1315-1317. |
| [26] |
黄现平, 李淑贤, 张玉冰. 高压氧联合脑心通胶囊治疗高血压脑出血患者疗效及对NO、ET-1、NPY水平的影响[J]. 黑龙江医药科学, 2023, 46(2): 93-94. |
| [27] |
王海燕, 周惠芬, 何昱, 等. 脑心通胶囊对缺糖缺氧损伤脑微血管内皮细胞的保护作用及其机制[J]. 中草药, 2018, 49(14): 3318-3325. |
| [28] |
WATANABE K, HASEGAWA Y, YAMASHITA H, et al. Vasohibin as an endothelium-derived negative feedback regulator of angiogenesis[J]. The Journal of Clinical Investigation, 2004, 114(7): 898-907. DOI:10.1172/JCI200421152 |
| [29] |
朱江兰, 石蓓. VASH对血管新生的调节作用[J]. 遵义医学院学报, 2013, 36(3): 281-284. |
| [30] |
NIE R Q, XIE S L, DU B, et al. Extracellular matrix metalloproteinase inducer(EMMPRIN) is increased in human left ventricle after acute myocardial infarction[J]. Archives of Medical Research, 2009, 40(7): 605-611. DOI:10.1016/j.arcmed.2009.09.001 |
| [31] |
FUJIWARA T, MATSUNAGA T, KAMEDA K, et al. Nicorandil suppresses the increases in plasma level of matrix metalloproteinase activity and attenuates left ventricular remodeling in patients with acute myocardial infarction[J]. Heart and Vessels, 2007, 22(5): 303-309. DOI:10.1007/s00380-007-0975-z |
| [32] |
LIU Y, SHAO Y H, ZHANG J M, et al. Macrophage CARD9 mediates cardiac injury following myocardial infarction through regulation of lipocalin 2 expression[J]. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2023, 8: 394. DOI:10.1038/s41392-023-01635-w |
| [33] |
门秀丽, 张丽萍, 吴静, 等. 线粒体形态与细胞凋亡的关系[J]. 生理科学进展, 2012, 43(5): 356-360. |
| [34] |
CUI J, SHI Y Y, XU X L, et al. Identifying the cardioprotective mechanism of Danyu Tongmai Granules against myocardial infarction by targeted metabolomics combined with network pharmacology[J]. Phytomedicine, 2022, 98: 153829. DOI:10.1016/j.phymed.2021.153829 |
| [35] |
郭志丽, 朱妍, 肖红斌, 等. 与脑梗死关联的氨基酸代谢通路研究进展与发现[J]. 中国医药导报, 2013, 10(26): 24-27. |
| [36] |
KANASHIRO-TAKEUCHI R M, TAKEUCHI L M, RICK F G, et al. Activation of growth hormone releasing hormone(GHRH) receptor stimulates cardiac reverse remodeling after myocardial infarction(MI)[J]. PNAS, 2012, 109(2): 559-563. DOI:10.1073/pnas.1119203109 |
| [37] |
DIOUFA N, SCHALLY A V, CHATZISTAMOU I, et al. Acceleration of wound healing by growth hormone-releasing hormone and its agonists[J]. PNAS, 2010, 107(43): 18611-18615. DOI:10.1073/pnas.1013942107 |
| [38] |
GRANATA R, TROVATO L, GALLO M P, et al. Growth hormone-releasing hormone promotes survival of cardiac myocytes in vitro and protects against ischaemia-reperfusion injury in rat heart[J]. Cardiovascular Research, 2009, 83(2): 303-312. DOI:10.1093/cvr/cvp090 |
| [39] |
WANG J X, JIAO J Q, LI Q, et al. miR-499 regulates mitochondrial dynamics by targeting calcineurin and dynamin-related protein-1[J]. Nature Medicine, 2011, 17(1): 71-78. DOI:10.1038/nm.2282 |
| [40] |
PIETZNER M, WHEELER E, CARRASCO-ZANINI J, et al. Mapping the proteo-genomic convergence of human diseases[J]. Science, 2021, 374(6569): eabj1541. DOI:10.1126/science.abj1541 |