支气管哮喘（bronchial asthma）简称哮喘，是由多种细胞（如嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞及气道上皮细胞等）和细胞组分共同参与的气道慢性炎症性疾患，这种慢性炎症导致气道反应性增加，当接触多种刺激因素时，气道发生阻塞和气流受限，出现反复发作的喘息、气促、胸闷、咳嗽等症状，常在夜间或清晨发作或加剧。GINA2023指南指出全球有3亿多人患有支气管哮喘^[1]，且肖惠迪等人研究发现2011—2018年中国儿童哮喘患病率为3.3%，并有逐年上升趋势，患者不仅生活、经济负担重，学业也会受影响^[2]。对于哮喘的控制目前仍以吸入性皮质类固醇（ICS）、β₂受体激动剂（SABA/LABA）、白三烯受体拮抗剂（LTRA）为主^[3]，但是长期使用糖皮质激素患者依从性较低，哮喘控制不佳。

中医药治疗是在改善体质的前提下控制哮喘，并对哮喘的共病^[4]如过敏性鼻炎、特应性皮炎、肥胖等有一定的改善作用，更加符合新型哮喘管理指南。近年来，肠道菌群对于免疫的调节广受关注，其对脑、肺、肝等都具有调节作用，与中医药治疗有异曲同工之妙，且其易受药物影响，进而影响其他脏腑^[5]。健脾补肺化痰方是哮喘缓解期的常用方，前期研究已证实健脾补肺化痰方可以通过降低黏膜下层EGF、MMP-9，VCAM-1、ICAM-1、VEGF以及IL-33和ECP含量减轻气道炎症、抑制气道重塑，通过减少Ⅲ型胶原蛋白增生和气道壁增厚，下调ERK1、PERK1、Ras及下调PDGF、TGF-β1、c-fos以抑制气道重塑^[6-12]以及能通过调节肠道菌群丰富度、增加部分短链脂肪酸（SCFAs）（乙酸、丙酸）及降低组胺（Histamine）水平，控制气道炎症^[13-14]。前期虽证实了健脾补肺化痰方能通过调节肠道菌群及其代谢物能控制气道炎症，但其发挥作用的时间不确定，故本研究旨在研究哮喘模型小鼠使用健脾补肺化痰方后几周SCFAs及组胺有何不同的变化及其潜在的作用机制。

1 实验材料 1.1 实验动物

16只SPF级雌性健康BALB/c小鼠，（21±3）日龄，体质量为16~18 g。购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：北京百善SCXK（京）2021-0006；本研究由安徽中医药大学实验动物伦理委员会批准，伦理编号：AHUCM-mouse-2022077。该样本量是根据资源方程法的组间公式n=DF/k+1（k为组数，n为每组受试动物数量，DF值为10~20）及单组重复测量公式N=DF/（r-1）+1（N为受试动物数量，r为重复测量的次数，DF值为10~20）算出来确定的。

1.2 实验药物

健脾补肺化痰方颗粒剂（黄芪20 g，太子参、白扁豆、薏苡仁各15 g，茯苓、白术、桔梗各10 g，陈皮6 g，砂仁3 g，炙甘草3 g）：由安徽中医药大学附属第一医院中药房提供。1剂健脾补肺化痰方溶于生理盐水46 mL，配制成浓度为2.55 g/mL的中药汤药。

1.3 实验主要试剂和仪器

鸡卵清蛋白（OVA）、SCFAs标准物质：美国Sigma公司；苏木素染液（批号03162211）、醇溶伊红染液（批号03092215）：中国ebiogo公司；乙醚：Greagent；磷酸：国药；小鼠组胺（Histamine）：武汉基因美科技有限公司JYM0450Mo & GR20220810。

冷冻离心机（湘仪H1850R）、高通量组织研磨器（美壁MB-96）、涡旋混匀仪（其林贝尔QL-866）、酶标仪（雷杜RT-6100）、离心机（安徽嘉文JW3021HR）、漩涡混合器（其林贝尔仪器制造公司GL-88B）、电热恒温箱（上海三发DNP-9052BS-Ⅲ）、气相色谱仪（Thermo Trace1310）、质谱仪（Thermo ISQ LT）。

2 实验方法 2.1 动物实验 2.1.1 复制支气管哮喘动物模型

16只小鼠适应性喂养2周后，按照参考文献^[15-16]复制动物模型，分为致敏和激发两个阶段。除空白对照组外的其他小鼠在第1天和第12天使用0.2 mL致敏液进行腹腔注射致敏。第18~23天每天用5%OVA激发液进行1次雾化（30 min/次）。第26~55天，5%OVA雾化频次降至为每周3次（30 min/次）。

2.1.2 动物处理

第56天时遵循完全随机原则，将模型复制成功的小鼠分为2组：模型组（MOD组）、中药+模型组（TCM组），每组8只。

2.1.3 药物干预方法

从实验的第57天起，模型组给予生理盐水代替药物灌胃。健脾补肺化痰方组[参照《药理实验方法学》中动物实验给药计量公式，结合临床用药标准、人与小鼠体型系数、小鼠灌药容量（10 μL/g）]每日给药剂量为25.5 g/（kg·d）。所有组别连续给药干预3周，每日1次，每次10 μL/g。

2.1.4 样本采集方法

药物干预第1、2、3、4周后分别在无菌环境下对小鼠进行抚触帮助排便，将新鲜粪便放于无菌冻存管，浸入液氮中快速冷冻，于-80 ℃冰箱保存；取材前禁食12 h，小鼠脱颈处死，解剖胸部，取出肺组织，用生理盐水漂洗干净，放入4%多聚甲醛固定液中。

2.2 指标检测及方法 2.2.1 一般情况观察

观察记录各组实验动物的精神状态、活动状况、呼吸、口鼻分泌物、咳嗽、食量、饮水量及毛发光泽度等情况。

2.2.2 夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测粪便中组胺浓度

按要求提取样本（粪便上清液）标准液，按说明书依次加入标准品进行稀释，然后将辣根过氧化物酶（HRP）-特异性组胺偶联抗体添加到每个微酶条带板孔中并孵育，并将TMB底物溶液添加到每口井中。用分光光度法在450 nm波长下测定光密度（OD）。通过比较样品的OD值和标准曲线，计算出样品中组胺的浓度。

2.2.3 气相色谱-质谱分析（GC-MS分析）检测粪便中的SCFAs

量取乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸纯标准品适量，用水混合配制成100 mg/mL的储备液，并用水稀释储备液得到系列工作标准溶液；量取己酸纯标准品适量，用乙醚混合配制成100 mg/mL的储备液，并用乙醚稀释储备液得到系列工作标准溶液。内标（4-甲基戊酸）用乙醚配制成375 μg/mL，200 μL 6种酸的系列工作标准溶液、100 μL 15%磷酸、20 μL己酸系列工作标准溶液、20 μL内标和260 μL乙醚混合配制成0.02、0.1、0.5、2、10、25、50、100、250、500 μg/mL十个标准曲线点。储备液保存于-20 ℃，各工作液现配现用。

取适量样本于1.5 mL离心管中，加500 μL水，加入100 mg玻璃珠，匀浆1 min，于4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，离心半径为6.23 cm，取200 μL上清，加100 μL 15%磷酸，再加375 μg/mL的内标（4-甲基戊酸）溶液20 μL和乙醚280 μL匀浆1 min，于4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清上机测试^[17]。

2.3 网络药理学分析^[18] 2.3.1 获取健脾补肺化痰方的相关靶点

将健脾补肺化痰方中的10味中药在中药系统药理数据库及分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）数据库中筛选出同时满足生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18的成分，然后在PubChem数据库获取SMILES号或对应成分结构图，将其导入至Swiss ADME平台，并设定肠胃吸收等级为“High”，依据Lipinski类药性原则从中挑选出能够达到以上两种标准的化合物，将其定义为潜在活性化合物；将10个药物的药效成分去重合并，即为健脾补肺化痰方的有效成分。然后再将选出的活性化合物导入至Swiss Target Prediction平台，设定选择物种类型为“homosapiens”，根据成分通过作用于该靶点产生活性的概率（即“probability>0”）阈值作为筛选条件以预测其作用靶点。

2.3.2 获取哮喘的相关靶点

在人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）、治疗靶点数据库（Therapeutic Target Database，TTD）、人类基因综合分析数据库（GeneCards）中检索哮喘的关键词“asthma”，得到与哮喘相关的靶点基因。

2.3.3 筛选核心靶点

为明确健脾补肺化痰方与哮喘间的相互作用，将两者靶点取交集，导入STRING12.0数据库，选择“Multiple proteins-homo sapiens”，默认设置进行PPI模型的构建。然后在Cytoscape3.9.1软件中使用Centiscape2.2插件，选择“Closeness unDir、Betweenness unDir、Degree unDir”运行得到相应的中位数数值，根据3个参数均超过此数值为标准筛选出核心靶点。

2.3.4 筛选与差异实验指标相关的靶点

将核心靶点及差异指标导入STITCH5.0数据库，在选择“Multiple names-homo sapiens”下再次进行PPI网络构建，通过该数据库选择出核心靶点中与差异指标有实验/生化数据或在特选数据库中有关联的第一级靶点，删除其他级靶点，最终得出健脾补肺化痰方中与哮喘、差异指标相关的靶点。

2.3.5 最终靶点的基因本位（GO）与基因组百科全书（KEGG）富集分析

将上述操作最终获得的“方-疾病-差异指标”共有靶点导入到DAVID数据库中，分别进行GO分析和KEGG分析。分别选取生物学过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞组成（cellular component，CC）中P值排名前10位的条目及P值排名前20位的KEGG信号通路，利用微生信网站（https://www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化分析。

2.3.6 分子对接验证

使用uniprot数据库获取2.3.4得到的相关靶点的相关蛋白结构，通过有机小分子生物活性数据库（pubchem）获得差异指标小分子的3D结构，并用pymol 3.7.0及AutoDockTools 1.5.6处理蛋白和小分子，然后通过AutoDock进行分子对接，最后运用pymol进行可视化分析。

2.4 统计学分析

使用GraphPad Prism 9进行统计学分析及作图，使用Excel计算数值并作图。正态分布数据描述为均数±标准差（x±s），非正态分布数据采用中位数（四分位数）。两组间比较根据情况采用t检验，多组间比较正态分布资料采用单因素方差分析（ANOVA），事后检验选用Turkey检验；Levene检验判断组间方差齐性。非正态分布资料采用Kruskal-Wallis检验（事后检验采用Dunn检验）。双侧P < 0.05认为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 粪便中组胺水平变化

组胺是肠道微生物产生的代谢物，也是支气管哮喘的关键炎症介质^[3]。检测粪便中组胺水平发现，TCM组用药1、2周后的组胺水平明显低于MOD组和TCM组用药3周后（P < 0.000 1）；与TCM组用药4周后相比，MOD组和TCM组用药3周后的组胺水平较高（P < 0.05），TCM组用药1周后的组胺水平较低（P < 0.05），见图 1。以上结果表明，健脾补肺化痰方可以降低哮喘模型小鼠的组胺水平，尤其在用药第1、2周后明显，第3周稍有上升后，第4周再次下降。

3.2 粪便中短链脂肪酸水平变化

SCFAs是肠道微生物群的众多代谢物的一种，在肺-肠轴中起重要作用^[19]。检测结果显示，TCM组用药1周后的异戊酸水平较MOD组、TCM用药2、3、4周后增高（均P < 0.05），TCM组用药1周后的乙酸、戊酸、己酸、异丁酸水平较MOD组、TCM用药3、4周后增高（均P < 0.05），TCM组用药1周后的丙酸水平较TCM用药4周后增高（P < 0.01），丁酸水平仅TCM组用药2周与用药4周有差异（P < 0.05），见图 2。

计算SCFAs增长比结果显示，与MOD组相比，TCM组用药1周后的丙酸、戊酸、异戊酸、异丁酸水平较其增长较多（均P < 0.05）；与TCM组用药4周后相比，用药1周后的异戊酸、丁酸、戊酸、异丁酸、丙酸水平较其增长较多（除丁酸外，均P < 0.05），见图 3。

故使用健脾补肺化痰方1周后，粪便中SCFAs除丁酸外，其他水平均有不同程度的升高，且戊酸、异戊酸、异丁酸、丙酸增长比更高。

3.3 药物-疾病的交集靶点

汇总在Swiss Target Prediction数据库得到的与健脾补肺化痰方的相关靶点，以及在OMIM、TTD、GeneCards数据库中查找到的哮喘（asthma）相关靶点，去除重复项，得到药物相关靶点892个，疾病相关1 716个靶点，将两类靶点取交集得到健脾补肺化痰方治疗哮喘的326个潜在靶点，见图 4。

3.4 PPI网络分析及核心靶点的获取结果

通过STRING数据库对交集靶点进行PPI分析，在Cytoscape3.9.1软件中使用Centiscape2.2插件，选择“Closeness unDir、Betweenness unDir、Degree unDir”运行得到相应的中位数数值，根据“Betweenness>313.21、Closeness>0.00159、Degree>47.26”筛选出59个核心靶点，见图 5。

3.5 获取核心靶点中与差异SCFAs及组胺的相关靶点

将核心靶点及戊酸、异戊酸、异丁酸、丙酸、乙酸、组胺导入STITCH5.0数据库再次进行PPI网络构建，通过该数据库选择出核心靶点中与差异指标有实验/生化数据或在特选数据库中有关联的第一级靶点，删除其他一级靶点，最终得出健脾补肺化痰方中与哮喘、差异指标相关的21个一级靶点，见图 6。其中AGTR1与乙酸、组胺、戊酸、丙酸均相关，与乙酸和组胺均相关的是CXCR4、AGTR1（图 6红色）。其余靶点多与组胺和乙酸相关，与乙酸相关的靶点主要有18个（图 6红色+黄色），与组胺相关的靶点主要有5个（图 6红色+蓝色）。因此，健脾补肺化痰方对哮喘的作用是存在多靶点的，可能通过丙酸、戊酸作用于AGTR1起作用，通过乙酸和组胺作用于CXCR4、AGTR1，以及其他相关靶点。

3.6 靶点生物功能富集及通路分析

将得到的最终21个靶点通过DAVID数据库运行，以P < 0.05值为前提，分别选取BP、MF、CC中P值排名前10位的GO条目及排名前20的KEGG条目应用微生信平台绘图，见图7。图7具体内容见开放科学（资源服务）标识码（OSID）。GO分析表明，BP主要涉及凋亡过程、细胞内信号转导、蛋白质磷酸化等；CC主要涉及质膜、细胞质、核质等；MF主要涉及蛋白质结合、ATP结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性等。KEGG分析表明，脂质和动脉粥样硬化、催乳素信号通路、人巨细胞病毒感染等是健脾补肺化痰方治疗哮喘的主要信号通路。其中与AGTR1相关的通路为Apelin信号通路、磷脂酶D信号通路、血管平滑肌收缩、钙信号通路，无相关BP；与CXCR4相关的通路为人巨细胞病毒感染、趋化因子信号通路、轴突引导、人类免疫缺陷病毒1型感染、肌动蛋白细胞骨架的调节、白细胞跨内皮迁移，相关BP为凋亡过程、细胞迁移的正调控；其中与CXCR4、AGTR1均相关的CC主要有质膜，MF涉及蛋白质结合，相关KEGG通路有钙信号通路（P < 0.05）。由此，健脾补肺化痰方可能主要通过催乳素信号通路、人巨细胞病毒感染等通路导致体内发生凋亡过程、细胞内信号转导、蛋白质磷酸化等发挥作用的。

3.7 分子对接验证靶点与实验指标的结果

将3.6中得到的靶点及相关指标运用分子对接后得出AGTR1与乙酸、组胺、丙酸、戊酸的结合能分别为：-2.92、-3、-3.17、-2.85 kcal/mol，CXCR4与乙酸、组胺的结合能分别为：-2.61、-3.59 kcal/mol，见表 1。乙酸、组胺、丙酸、戊酸与AGTR1和乙酸、组胺与CXCR4的结合能均 < 0 kcal/mol，这说明各自能自发的相结合；并用pymol软件进行可视化分析可以直观看出各自结合能最低时的对接情况，见图8。图8的具体内容见OSID。

4 讨论

哮喘是由结构细胞（气道上皮细胞）及免疫细胞（嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等）变化导致的气道慢性炎症。近年来，越来越多人研究肠道菌群及其代谢物对哮喘的影响。首先肺部和肠道均有相似的黏膜免疫^[20]，其次两者内部均有大量微生物，且有研究发现肺部微生物与肠道微生物相互影响，但具体机制尚未研究清楚，目前只能证明肠道微生物产生的代谢物入血影响肺部疾病^[20–22]。肺泡灌洗液和肠道中最常见的门均为厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门^[23-24]，组胺和SCFAs是对肺部疾病影响中主要的肠道菌群代谢物，厚壁菌门与拟杆菌门是产生SCFAs和组胺的两种优势菌。前期实验表明，健脾补肺化痰方持续使用3周后能增加拟杆菌门、放线菌门和减少厚壁菌门丰富度，下调组胺和升高SCFAs（乙酸、丙酸）以降低气道炎症以减轻哮喘^[25]，但对于SCFAs与组胺是持续发挥作用还是间断起效是有疑问的。

组胺在体内的来源：一是由肥大细胞产生，二是由于肠道微生物代谢产生，三是随食物进入体内。组胺入血进入肺部，与气道上皮及肺组织中H1-4受体结合，发挥收缩气道平滑肌、增加血管通透性、增加黏液分泌等作用^[26]。本研究中哮喘模型小鼠在使用健脾补肺化痰方后第1、2、4周，组胺下降明显，结合前期^[13]结果来看，第3周的突然升高可能由于检测误差导致，因此，健脾补肺化痰方下调组胺的作用可能是持续的。

SCFAs是由肠道微生物群在肠道中通过将膳食纤维厌氧发酵产生，通过被动扩散及主动转运方式入血，将其输送到肺部，激活G蛋白偶联受体（GPCRs）或丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），或发挥HDAC抑制剂的作用，在肺部减轻气道炎症或气道高反应^{[19, 27]}。其中乙、丙、丁酸盐均能激活GPR43受体，抑制促炎因子（如TNF、IL-6等），且能抑制HDAC，对中性粒细胞及嗜酸性粒细胞产生凋亡作用，以此发挥抗炎活性^[27]。本研究发现SCFAs基本在用药后第1周有所增加，尤其戊酸、异戊酸、异丁酸、丙酸增长比较明显，而丁酸没有如此明显的变化，这与往常发现的乙酸、丁酸、丙酸发挥的作用不同，也许是因为增加的时间段不同等。

乙酸、组胺、戊酸、丙酸共有的潜在靶点AGTR1是血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的1型受体，两者结合可参与细胞增殖、左室肥厚、血管中层肥厚、动脉粥样硬化、新生内膜形成和肾硬化等心血管疾病相关过程。同时研究发现AngⅡ与AGTR1结合能够促炎、增加气道高反应。

乙酸和组胺共有的潜在靶点CXC趋化4受体（CXCR4）是一种G蛋白偶联受体，与基质细胞衍生因子1（SDF-1）共同作用可以趋化炎症细胞、调节其他细胞因子的表达、增加黏蛋白表达及促进血管新生、重建等，从而导致气道炎症和气道重塑及气道黏液高分泌。哮喘急性发作时，不仅有气道炎症，还有气道高反应，因此，本研究发现在使用健脾补肺化痰方后1周，可能通过升高乙酸、戊酸、丙酸与下调组胺作用于AGTR1或CXCR4对气道高反应及气道炎症发挥抑制作用，而异丁酸和异戊酸增长较高，但目前未有报道过与哮喘相关的作用机制，后续可进一步研究。

结合GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，健脾补肺化痰方后1周，可能通过升高乙酸与下调组胺作用于CXCR4靶点与人巨细胞病毒感染、趋化因子信号通路、轴突引导、人类免疫缺陷病毒1型感染、肌动蛋白细胞骨架的调节、白细胞跨内皮迁移、钙信号通路相关，升高乙酸、戊酸、丙酸与降低组胺作用于AGTR1靶点与Apelin信号通路、磷脂酶D信号通路、血管平滑肌收缩、钙信号通路有关。

其中与两靶点均相关的钙信号通路在气道上皮中十分重要，它能刺激气道上皮产生趋化因子、细胞因子等，从而导致气道炎症；并且Muqeet Wahid等发现能通过抑制钙信号通路来改善呼吸系统疾病。关于趋化因子信号通路，CXCR4本身就是一种趋化因子受体，王坤等发现抑制其上游的Notch信号通路能增强SDF-1和CXCR4趋化因子轴的表达，以改善Th1/Th2失衡来治疗哮喘的气道炎症。当发生过敏反应时会出现血管平滑肌松弛、支气管平滑肌收缩等，哮喘发作时也是一种过敏反应，所以激活血管平滑肌收缩通路能减轻哮喘发作时的过敏症状。

综上所述，健脾补肺化痰方对于哮喘模型小鼠的SCFAs与组胺的影响中，其对于组胺的影响更持久，维持在用药后第1~2周，甚至持续4周；而对于SCFAs而言，在用药后第1周时，且戊酸、异戊酸、异丁酸增长更明显。通过网络药理学及分子对接分析得出，健脾补肺化痰方对哮喘的治疗作用可能是多靶点的，在哮喘早期可能通过乙酸、戊酸、丙酸、组胺作用于AGTR1、CXCR4等靶点发挥减轻气道炎症及气道高反应的作用，并且与趋化因子信号通路、血管平滑肌收缩、钙信号通路等相关。