急性肝损伤是由于药物中毒、病毒感染、免疫反应等原因引发的肝功能异常及肝细胞损伤^[1]。目前急性肝损伤有多种建模方式，但四氯化碳（CCl₄）构建小鼠急性肝损伤模型因其造模效果较佳、操作要求低但重复性高而被广泛认可、应用^[2]。急性肝损伤目前尚无有效的治疗方法，多数患者会发展为肝纤维化、肝癌，甚至威胁其生命^[3]。研究发现中药作为近年来研究的热点，在治疗肝损伤中疗效显著，如姜黄^[4]。急性肝损伤的临床症状多为食欲不振、身目黄染、胁痛等，故中医认为急性肝损伤属于黄疸、胁痛等范畴，其病因在于外感药毒之邪，或先天禀赋不足，或机体正气亏虚，其治疗方法应以滋阴补肾、疏肝理气、补血活血及调和肝脾为宗旨^[5-6]。炙甘草汤由多种药物构成，如炙甘草、生姜、人参、桂枝、麻仁、麦冬等，为甘温之润剂，其中炙甘草可益气滋阴、补脾和胃、通阳复脉；人参可滋补肝肾、生津养血；阿胶、大枣具有滋阴补血的功效；桂枝性温、甘，具有杀菌抗病毒、滋而不腻、消炎止痛等多种药理作用；生姜、麦冬具有镇痛抗炎、抗氧化、提高免疫力、抗癌等作用，单味药的药理作用应用广泛，使得该汤药在多种疾病中被研究^[7-9]，但其在急性肝损伤中研究甚少^[10]。据报道氧化应激、炎症反应往往参与CCl₄建立的急性肝损伤^[11]。沉默信息调节因子1（SIRT1）是一种组蛋白脱乙酰酶，过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活剂-1α（PGC-1α）是SIRT1的下游靶标，在各种疾病中起着关键作用，包括氧化应激、衰老和炎症^[12]，且已有研究表明SIRT1/PGC-1α通路是治疗肝损伤的潜在靶点^[13]。同时，激活SIRT1/PGC-1α通路有助于减轻药物诱导的肝损伤^[14]。鉴于此，本研究旨在探讨炙甘草汤对CCl₄导致小鼠急性肝损伤的影响及相关作用机制。

1 材料 1.1 动物

北京斯贝福生物技术有限公司提供70只C57BL/6 J雄性小鼠[体质量（20±3）g，7周龄，SPF级]，许可证号：SCXK（京）2019-0010。小鼠饲养在合适的湿度、温度的SPF级动物房中，12 h光照/12 h明暗交替循环，自由饮水、进食，该研究已获得动物护理和使用委员会的批准（202306008）。

1.2 药物与试剂

北京德寿堂药房提供炙甘草、麦冬、麻仁、阿胶、桂枝、生地黄等炙甘草汤组方，小火浓煎至生药含量3 g/mL；上海源叶生物科技有限公司提供SIRT1抑制剂sirtinol（批号S80707）；上海士锋生物科技有限公司提供奥贝胆酸（批号20052315）；建成生物工程研究所提供白细胞介素（IL）-6（批号20220105）、丙二醛（MDA）（批号20100813）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）（批号20220120）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）（批号20190120）、超氧化物歧化酶（SOD）（批号20100811）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）（批号20190110）试剂盒；Abcam公司提供SIRT1（批号ab110304）、PGC-1α（批号ab176328）一抗。

1.3 仪器

美国BioTek公司提供Epoch长酶标仪；Leica公司提供光学显微镜；美国Scilogex公司提供D3024R离心机。

2 方法 2.1 实验小鼠干预、分组及模型构建

喂养1周的C57BL/6 J小鼠随机分为对照组、CCl₄组、炙甘草汤低、中、高（炙甘草汤-L、炙甘草汤-M、炙甘草汤-H）剂量组、炙甘草汤-H+sirtinol组、奥贝胆酸组，每组10只。其中对照组以10 mL/kg橄榄油腹腔注射，其余各组以10 mL/kg 0.1% CCl₄腹腔注射进行构建急性肝损伤^[15]，禁食24 h后，炙甘草汤-L、炙甘草汤-M、炙甘草汤-H组分别给予2 mL/kg、4 mL/kg、8 mL/kg的炙甘草汤灌胃干预^[16]；炙甘草汤-H+sirtinol组给予8 mL/kg的炙甘草汤灌胃干预同时，尾部静脉注射2 mg/kg sirtinol干预^[17]；奥贝胆酸组以30 mg/kg奥贝胆酸灌胃干预^[18]；对照组、CCl₄组分别给予等体积的生理盐水干预，每天干预1次。

2.2 小鼠一般状况

观察小鼠饮食、精神状态；造模完成后16 h，麻醉小鼠，采集血液，并分离小鼠肝脏，观察颜色及质地。

2.3 检测小鼠肝功能

造模完成后16 h，腹腔注射巴比妥钠麻醉小鼠，仰卧位固定在操作板上，右手持采血管，从眼眶内侧（靠近鼻侧）轻轻插入，将采集血液迅速注入无菌离心管中，离心半径15 cm，以3 000 r/min离心10 min，用移液器小心吸取血清，按照试剂盒步骤检测AST、ALT水平。

2.4 检测小鼠血清中炎症因子水平

取2.3中血清样本，酶联免疫吸附实验（ELISA）检测血清中TNF-α、IL-6水平。

2.5 检测小鼠肝脏组织中氧化应激水平

收集小鼠部分肝脏组织，并进行组织匀浆，检测肝脏组织中MDA、SOD水平。

2.6 检测肝脏组织病理学变化

用生理盐水清洗小鼠部分肝脏，并用10%中性福尔马林固定，并将组织脱钙、包埋在石蜡中，切成厚度约4 μm切片，将切片用二甲苯脱蜡，梯度酒精水合、苏木精-伊红（HE）溶液、天狼猩红染色，光镜下观察肝脏组织病理学变化。

2.7 SIRT1/PGC-1α通路相关蛋白表达

收集小鼠部分肝脏组织，将组织剪成小块，加入适量的预冷放射免疫沉淀实验裂解液，使用匀浆器在冰上匀浆、裂解，裂解后的样品离心，用移液器小心吸取上清液，并测定其浓度，经电泳分离、转模后进行封闭，随后加入SIRT1、PGC-1α一抗孵育过夜，之后以二抗孵育、增强化学发光试剂曝光显影，Image J软件分析灰度值。

2.8 统计学方法

采用SPSS 27.0软件分析实验数据，P < 0.05时，认为差异有统计学意义。数据以均数±标准差（x ± s）表示，单因素方差分析用于多组间比较，符合正态分布和方差齐性，以SNK-q检验进一步两两比较。

3 结果 3.1 炙甘草汤对各组小鼠一般状况影响

对照组小鼠活动量正常，皮毛光泽，精神状态较佳，肝脏光滑，无颗粒感，呈鲜红色；CCl₄组小鼠精神涣散，慵懒，皮毛无光泽，肝脏粗糙，呈暗红色；炙甘草汤-L、炙甘草汤-M、炙甘草汤-H组、炙甘草汤-H+sirtinol组、奥贝胆酸组小鼠状态及肝脏外观得到改善，见图 1。

3.2 炙甘草汤对小鼠肝功能的影响

与对照组相比，CCl₄组血清中AST、ALT水平增加（P < 0.01）；与CCl₄组相比，炙甘草汤-L、炙甘草汤-M、炙甘草汤-H组、奥贝胆酸组血清中AST、ALT水平降低，不同浓度炙甘草汤差异具有统计学意义（P < 0.01），但炙甘草汤-H组与奥贝胆酸组无差异（P > 0.05）；与炙甘草汤-H组相比，炙甘草汤-H+sirtinol组血清中AST、ALT水平增加（P < 0.01），见表 1。

3.3 炙甘草汤对小鼠血清中炎症因子的影响

与对照组相比，CCl₄组血清中TNF-α、IL-6水平增加（P < 0.01）；与CCl₄组相比，炙甘草汤-L、炙甘草汤-M、炙甘草汤-H组、奥贝胆酸组血清中TNF-α、IL-6水平降低，不同浓度炙甘草汤具有统计学差异（P < 0.01），但炙甘草汤-H组与奥贝胆酸组无差异（P > 0.05）；与炙甘草汤-H组相比，炙甘草汤-H+sirtinol组血清中TNF-α、IL-6水平增加（P < 0.01），见表 2。

3.4 炙甘草汤对小鼠肝脏组织中氧化应激的影响

与对照组相比，CCl₄组肝脏组织MDA增加，SOD降低（P < 0.01）；与CCl₄组相比，炙甘草汤-L、炙甘草汤-M、炙甘草汤-H组、奥贝胆酸组肝脏组织MDA降低，SOD增加，不同浓度炙甘草汤具有统计学差异（P < 0.05），但炙甘草汤-H组与奥贝胆酸组无差异（P > 0.05）；与炙甘草汤-H组相比，炙甘草汤-H+sirtinol组肝脏组织MDA增加，SOD降低（P < 0.01），见表 3。

3.5 炙甘草汤对小鼠肝脏组织病理变化的影响

对照组小鼠结构完整，细胞结构清晰、排列有序，无炎性浸润；CCl₄组细胞出现坏死及炎性浸润；炙甘草汤-L、炙甘草汤-M、炙甘草汤-H组、奥贝胆酸组细胞逐渐排列有序，肝损伤程度降低，以炙甘草汤-H组、奥贝胆酸组炎性浸润、细胞坏死等改善最为明显；炙甘草汤-H+sirtinol组细胞肿胀、浸润较炙甘草汤-H组严重，见图 2。

对照组小鼠肝小叶结构完整；CCl₄组有胶原纤维增生产生，肝小叶被破坏；炙甘草汤-L、炙甘草汤-M、炙甘草汤-H组、奥贝胆酸组胶原沉积得到改善，以炙甘草汤-H组、奥贝胆酸组改善最为明显；炙甘草汤-H+sirtinol组胶原沉积程度较炙甘草汤-H组严重，见图 3。

3.6 炙甘草汤对SIRT1/PGC-1α通路相关蛋白表达的影响

与对照组相比，CCl₄组SIRT1、PGC-1α表达降低（P < 0.01）；与CCl₄组相比，炙甘草汤-L、炙甘草汤-M、炙甘草汤-H组、奥贝胆酸组SIRT1、PGC-1α表达增加，不同浓度炙甘草汤具有统计学差异（P < 0.01），但炙甘草汤-H组与奥贝胆酸组无差异（P > 0.05）；与炙甘草汤-H组相比，炙甘草汤-H+sirtinol组SIRT1、PGC-1α表达降低（P < 0.01），见图 4、表 4。

4 讨论

肝脏被认为是身体的重要器官，参与调节物质的生物转化和解毒^[19]。CCl₄是一种众所周知的肝毒素，可以通过氧化应激、炎症反应等多种机制诱导肝损伤，可用于药物治疗或开发^[20]。急性肝损伤可发展成急性肝衰竭，预后差且病死率高^[21]，迄今为止，还没有发现治疗急性肝损伤的有效方法。

急性肝损伤的发生机制较为复杂，氧化应激被认为是CCl₄诱导肝损伤的主要发病过程。当机体受到某些有害因素刺激时，过量的活性氧的产生导致氧化-抗氧化防御系统失衡，引发抗氧化酶SOD活性降低，同时脂质过氧化产物MDA增加。细胞炎性浸润发生，肝组织细胞损伤加剧，细胞膜通透性增加，ALT和AST可以大量释放到血液中^[22]。当CCl₄诱导急性肝损伤时，多种细胞被激活，引起促炎因子TNF-α的释放，可直接或间接地导致肝细胞坏死，其诱导IL-6的产生，又加重肝损伤的发生^[23-24]。研究发现CCl₄诱导的小鼠血清中肝功能指标AST、ALT水平与炎症因子TNF-α、IL-6水平明显增加，肝脏组织MDA显著增加，SOD水平降低，肝脏组织形态也出现明显的病理改变，这与LI等^[25]研究的结果一致，提示CCl₄诱导的小鼠肝功能异常，氧化应激及炎症反应明显增加。急性肝损伤的治疗应以调和肝脾、疏肝理气、扶正补虚为主，同时辅以清热药物^[26]，而炙甘草汤源自汉代张仲景的《伤寒论》，为补益剂，具有益气滋阴，通阳复脉之功效。主治阴血阳气虚弱，心脉失养证，其中生姜调和胃气、降逆止呕；炙甘草、大枣益气和中，扶正祛邪，在小柴胡汤中作为重要成分，发挥保护肝损伤的作用；而人参作为传统名贵中药，可以增强肝脏代谢酶活性以发挥解毒功能，具有抗肝损伤作用^[27]。桂枝在助脾气上升的同时，与麦冬相配又可理肝气，诸药合用达到驱邪扶正、养阴益气等功效，且药理学研究表明该汤药具有抗氧化、抗炎以及提高免疫力的作用，副作用少、安全性高^[28-29]。在乙型肝炎肝硬化腹水研究中^[30]，炙甘草汤联合猪苓汤治疗效果显著。研究发现，炙甘草汤干预后，小鼠肝功能得到改善，TNF-α、IL-6水平下降，肝脏组织MDA下降，SOD水平增高，肝组织损伤得到缓解，表明炙甘草汤可抑制肝组织的氧化应激反应和全身炎症，通过其抗氧化和抗炎作用改善CCl₄诱导的急性肝损伤，未来需要进一步的临床研究来验证其疗效及机制。

肝损伤的主要致病基础是CCl₄引发的炎症反应、氧化应激，因此治疗肝病的有效手段是抑制肝组织氧化应激及炎症反应^[31]。线粒体是肝细胞中氧化代谢的主要场所和主要能量来源，参与维持肝功能，而氧化应激是大多数肝病的共同特征^[32]。激活SIRT1信号可一定程度抑制氧化应激发生，抑制肝细胞凋亡，改善急性肝损伤，PGC-1α是SIRT1下游因子，是线粒体生物发生和功能以及氧化应激的关键调节因子^{[18, 33]}。在乙醇诱导的肝损伤中，烟酰胺核苷提供激活SIRT1/PGC-1α通减少脂质积聚及线粒体生物合成，减轻肝组织受损^[34]。化瘀祛痰方可抑制炎性反应，改善肝脏脂质沉积，与SIRT1/PGC-1α信号通路调节线粒体功能相关^[35]。研究发现CCl₄诱导的小鼠肝组织中SIRT1、PGC-1α表达降低，提示CCl₄引发的肝损伤可能与SIRT1/PGC-1α通路被抑制有关。但经炙甘草汤干预后，SIRT1、PGC-1α表达上调，肝功能及损伤得到改善，推测炙甘草汤可能通过上调SIRT1/PGC-1α通路减轻CCl₄引发的肝损伤。为进一步核验该机制，实验以SIRT1抑制剂-sirtinol进行验证，结果发现sirtinol逆转了炙甘草汤对CCl₄引发的肝损伤的保护作用，表明炙甘草汤通过上调SIRT1/PGC-1α通路调节线粒体功能，抑制炎症反应和氧化应激，进而保护CCl₄引发的肝损伤。

综上所述，炙甘草汤可能通过上调SIRT1/PGC-1α保护CCl₄引发的肝损伤，可能与上调SIRT1/PGC-1α通路有关，但仍需进一步的研究来验证其具体机制和临床应用潜力。