慢性疲劳综合征（CFS）是一种临床常见的涉及多系统障碍的复杂慢性疾病^[1]，其特征是排除其他疾病情况下的持续6个月或更长时间的疲劳，且不能通过休息、睡眠或减少身体劳动缓解，并至少伴有以下4种症状：劳累后不适、认知障碍、睡眠障碍、肌肉疼痛、淋巴结疼痛等^[2]。CFS具有持续性和复发性的特点，严重影响患者的生活质量^[3]。

CFS的发生与多种因素有关，其中研究最多的有能量代谢受损、5-羟色胺（5-HT）系统过度活跃等^[4]。在能量代谢方面，研究发现CFS患者的骨骼肌细胞存在AMP依赖性蛋白激酶（AMPK）激活障碍，这被认为是CFS患者骨骼肌细胞中三磷酸腺苷（ATP）水平低于正常水平及CFS发生的重要原因^[5]。AMPK是一种对能量变化和转化极其敏感的且对AMP存在依赖性的蛋白激酶，在能量产生及营养物质代谢过程中发挥重要作用^[6]，AMPK的磷酸化激活受到一磷酸腺苷/ATP、腓肠肌钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶2（CaMKK2）、苏氨酸蛋白激酶（LKB1）等因子的调节，磷酸化激活的AMPK可以上调过氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子1α（PGC-1α）的表达，改善能量代谢^[7]。研究发现，在CFS相关动物模型中，激活腓肠肌AMPK/PGC-1α可以增加运动耐力，减少疲劳相关标志物，增加能量产生，缓解疲劳症状^[8]，提示促进AMPK激活，改善能量产生，对于缓解CFS症状具有重要作用。

中医认为CFS患者本质为脏腑正气不足，气虚则脾失健运，痰湿内生^[9]。清金益气颗粒为张伯礼院士临床经验方，2025年1月3日获国家药品监督管理局批准上市，药物名称为益气清肺颗粒（国药准字C20250002）。全方由生脉散合平胃散加减而成，由人参、麦冬、五味子等16味中药组成，具有益气养阴、健脾和中、清热祛湿等功效^[10]。临床研究表明益气清肺颗粒可以有效改善新型冠状病毒感染恢复期患者的疲劳与呼吸困难症状^[11]，但其对CFS是否具有治疗作用尚不明确，故本研究通过强迫游泳训练建立CFS小鼠模型，拟从AMPK信号通路角度探索益气清肺颗粒对CFS小鼠的潜在治疗作用，为CFS的研究与治疗提供一定实验依据。

1 实验材料与方法 1.1 实验药品及试剂

益气清肺颗粒由天津中一制药有限公司提供（生产批号：8960007）。肝/肌糖原测定试剂盒（生产批号：A043-1-1）、乳酸（LA）测试盒（生产批号：A019-2-1）、尿素氮（BUN）测试盒（生产批号：C013-2-1）及ATP含量测定试剂盒（生产批号：A095-1-1）购自南京建成生物工程研究所；5-HT酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（生产批号：CSB-E08465m）购自武汉华美生物工程有限公司；色氨酸检测试剂盒（生产批号：CED720Ge）购自武汉云克隆科技股份有限公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（生产批号：PC0020）购自北京索莱宝科技有限公司；CaMKK2抗体（生产批号：16810S）、AMPK抗体（生产批号：5831S）、磷酸化AMPK（p-AMPK）抗体（生产批号：50081S）、β-tubulin抗体（2128S）购自美国CST公司；PGC-1α抗体（生产批号：ab191838）购自英国Abcam公司；去乙酰化酶3（SIRT3）抗体（生产批号：A22409）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；电化学发光（ECL）发光底物（生产批号：KF8003）购自Affinity Biosciences公司。

1.2 实验动物

6~8周龄SPF级雄性balb/c小鼠，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：SCXK（京）20190008。小鼠饲养于天津中医药大学医学实验动物中心，所有操作均遵守天津中医药大学实验动物伦理要求，伦理编号：TCM-LAEC2022223。

1.3 实验仪器

转棒式疲劳仪（型号：YLS-4C，济南益延科技发展有限公司）；SPARK多功能酶标仪（型号：Infinite F50，帝肯贸易有限公司）；高速冷冻离心机（型号：Sorvall Legend Micro 21R，美国Thermo公司）；恒温水浴锅（型号：NK-420，常州诺基仪器有限公司）；自制游泳箱（规格：60 cm×50 cm×40 cm，尧顺塑料制品厂）；恒温金属浴（型号：DKT-100，杭州米欧仪器有限公司）；微型旋涡混合仪（型号：WH-3，上海沪西分析仪器厂有限公司）；免疫印迹化学发光成像系统（型号：Amersham Imager 680，Cytiva公司）。

1.4 实验方法 1.4.1 分组

balb/c小鼠在温度为20~25 ℃、湿度为30%~50%、光照周期12 h昼/12 h夜的环境中适应性饲养1周。在此期间进行游泳训练，每只小鼠进行无负重游泳，记录力竭游泳时间并剔除不会游泳的小鼠，随后进行转棒实验，剔除耐力异常的小鼠，采用随机数字分组法将小鼠随机分为空白组、模型组、益气清肺颗粒低剂量组（2.4 g/kg）、益气清肺颗粒中剂量组（4.8 g/kg）、益气清肺颗粒高剂量组（9.6 g/kg），每组8只。

1.4.2 造模及给药

空白组和模型组小鼠每日给予生理盐水，给药组小鼠按照同等剂量给予益气清肺颗粒溶液，灌胃体积均为10 mL/kg，连续给药6周，每日1次。每日灌胃1 h后，除空白组外，其余各组小鼠进行强迫游泳训练，尾部负重质量每周参照体质量比例递增2%，直至达到8%，每日游泳2 h。

1.4.3 行为学实验 1.4.3.1 力竭游泳实验

第37天给药后1 h，在小鼠尾根处系上相当于8%体重量的铅丝，依次放入水深约30 cm、水温为（25±1）℃的游泳箱中游泳，以小鼠头部沉入水中8 s内未浮出水面作为判断小鼠力竭的标准，记录此时间为小鼠的游泳力竭时间。

1.4.3.2 转棒实验

第38、39、40天进行转棒实验，前2 d为适应训练，第1天设置转速为15 r/min，第2天设置转速为25 r/min，每只小鼠每日训练30 min，第40天为正式实验，记录小鼠在转速为25 r/min的疲劳转棒仪上从平稳运动到跌落的时间。

1.4.4 小鼠血清及组织样本收集

第43天，所有小鼠负重强迫游泳2 h、休息24 h后吸入异氟烷麻醉并进行摘眼球取血，静置45 min，2 500 r/min离心20 min（离心半径为10 cm），将血清分装并转移至-80 ℃冰箱保存，脱颈椎处死小鼠后摘取腓肠肌、肝脏组织，用生理盐水洗净血渍，滤纸吸干组织表面水分并称取质量，随后转移至-80 ℃冰箱中冷冻保存。

1.4.5 肌糖原、肝糖原、色氨酸、5-HT测定

称取肌肉和肝脏组织50 mg，加入3倍体积的氢氧化钠溶液煮沸20 min得到糖原水解液，自然冷却至室温，按照试剂盒说明书要求检测肌肉及肝脏中糖原含量。

取大脑左半球于离心管中，加入预冷的磷酸缓冲盐溶液（PBS），制成匀浆，反复冻融2次，5 000 r/min离心5 min（离心半径为10 cm），离心后取上清，按照说明书要求检测色氨酸、5-HT含量。

1.4.6 腓肠肌LA、BUN、ATP测定

取适量血清进行预实验，探究血清最佳稀释比例，并按照说明书要求检测血清中LA、BUN含量。

称取腓肠肌组织30 mg，加入9倍体积的冷双蒸水，冰水浴匀浆，3 500 r/min离心10 min（离心半径为10 cm），取上清，并按照说明书要求检测腓肠肌中ATP水平。

1.4.7 蛋白免疫印迹（Western blot）实验

每组随机选取4只小鼠的腓肠肌组织用于Western blot实验。称取30 mg小鼠腓肠肌置于裂解液中，使用超声破碎仪对组织进行超声处理，4 ℃、12 000 r/min条件下离心20 min（离心半径为10 cm），得到组织上清液，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度，取等量蛋白质加入5×loading buffer，100 ℃煮沸10 min得到实验样品。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离样品，将样品转移至活化的聚偏氟乙烯膜上，使用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入抗CaMKK2（1∶2 000）、AMPK（1∶2 000）、p-AMPK（1∶2 000）、PGC-1α（1∶1 000）、SIRT3（1∶1 000）的一抗4 ℃过夜；用聚丁二酸-共-对苯二甲酸丁二醇酯（PBST）清洗3次，每次10 min，加入对应二抗，室温孵育1 h，PBST洗3次，每次10 min，随后采用ECL法显影曝片，使用Image J软件分析计算蛋白灰度值，将每组4只小鼠的蛋白灰度值取平均值用于统计学分析。

1.4.8 统计学分析

所有实验数据以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 25.0软件进行数据分析，当数据符合正态分布且满足方差齐性时，组间比较采用单因素方差分析，不同时满足正态分布及方差齐性的数据采用非参数检验，P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 益气清肺颗粒对小鼠日常状态的影响

造模初期各组小鼠的粪便、毛发、活动程度等一般状况无明显异常。随着造模的进行，模型组小鼠出现体型瘦弱，皮毛稀疏且稍发黄，精神明显倦怠，游泳时闭眼不动时间延长；各给药组小鼠的皮毛较光滑，活泼好动，游泳速度快。

2.2 益气清肺颗粒对小鼠运动耐力的影响

各组小鼠的初始力竭游泳时间、转棒时间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。连续造模6周后，模型组小鼠较空白组小鼠的力竭游泳时间、转棒时间缩短（P < 0.01）；与模型组比较，益气清肺颗粒干预不同程度地延长了小鼠力竭游泳时间与转棒时间（P < 0.05或P < 0.01），其中益气清肺颗粒中剂量组小鼠的力竭游泳时间和转棒时间最久。见表 1。

2.3 益气清肺颗粒对小鼠疲劳相关生化指标的影响

与空白组比较，模型组小鼠肌糖原、肝糖原含量及腓肠肌ATP水平降低（P < 0.05或P < 0.01）；与模型组比较，益气清肺颗粒低、中、高剂量组小鼠的肌糖原、肝糖原含量及ATP水平升高（P < 0.05或P < 0.01）。与空白组比较，模型组小鼠血清中LA、BUN水平升高（P < 0.01），益气清肺颗粒干预6周后，各给药组小鼠血清中LA、BUN水平较模型组降低（P < 0.05或P < 0.01）。见表 2。

2.4 益气清肺颗粒对小鼠脑组织中色氨酸和5-HT的影响

模型组小鼠脑组织中色氨酸和5-HT水平较空白组升高（P < 0.05或P < 0.01）；与模型组比较，益气清肺颗粒干预6周后，小鼠脑组织中色氨酸和5-HT水平降低（P < 0.05）。见表 3。

2.5 益气清肺颗粒对小鼠腓肠肌AMPK/PGC-1α/SIRT3信号通路的影响

与空白组比较，模型组小鼠腓肠肌中p-AMPK、PGC-1α及SIRT3蛋白的表达水平降低（P < 0.01）；与模型组比较，益气清肺颗粒中剂量组小鼠腓肠肌中p-AMPK、PGC-1α、SIRT3蛋白表达水平增加（P < 0.05或P < 0.01），益气清肺颗粒高剂量组小鼠腓肠肌中p-AMPK、SIRT3蛋白表达水平增加（P < 0.05），PGC-1α有上升趋势但差异无统计学意义（P > 0.05），益气清肺颗粒低剂量组小鼠腓肠肌中3种蛋白表达水平有上升趋势，但差异无统计学意义（P > 0.05）。各组小鼠腓肠肌中CaMKK2蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 1及表 4。

3 讨论

CFS是临床常见慢性疾病之一，持续的无法缓解的疲劳、运动不耐受及睡眠障碍是CFS的典型临床症状^[12]。目前研究多认为该疾病的发生与能量代谢受损、神经-内分泌系统异常、氧化还原失衡、免疫反应失调、肠道菌群失调等有关^[13]。由于CFS的病因尚不明确，西医主要通过对症治疗，如使用营养补充剂、止痛药、抗焦虑药及免疫调节药物等来缓解患者不适，疗效有限且长时间服用极易产生不良反应^[14]。诸多研究表明，中医药在改善CFS症状方面具有一定优势^[15]，而益气清肺颗粒在临床上展示出了较好的抗疲劳作用，故本研究以益气清肺颗粒为研究对象，采用6周强迫游泳方法建立CFS模型，通过观察小鼠日常状态，检测其运动耐力、疲劳相关指标来评估益气清肺颗粒对CFS小鼠的治疗作用。

运动耐力是评价疾病模型以及药物抗疲劳效果的直观指标。力竭游泳实验和转棒实验广泛应用于评估实验动物的运动耐力与疲劳抗性^[16]。本研究发现，6周的强迫游泳训练使得小鼠状态疲惫，力竭游泳时间、转棒时间显著缩短，提示强迫游泳训练诱导小鼠CFS模型建立成功，这与张馨芸等^[17]的研究结果一致。给予益气清肺颗粒可以改善小鼠的疲劳精神状态，显著延长小鼠的力竭游泳时间与转棒时间，提示益气清肺颗粒可以提高CFS小鼠运动耐力，改善疲劳状态，对CFS小鼠具有治疗作用。

能量代谢障碍在CFS的发生和发展过程中发挥着不可忽视的作用。研究发现，CFS患者外周血单个核细胞，中细粒细胞中ATP的可用性低于正常水平^[18]。此外，肌肉活体组织检查中也发现骨骼肌的线粒体结构异常，能量生成异常^[19]。因此，部分学者认为ATP可用性降低导致了慢性疲劳及运动后不适的发生，改善能量代谢障碍状态成为了CFS的潜在治疗方向。糖原作为葡萄糖的储存库，可以在需要时快速转化为葡萄糖进行氧化供能，产生ATP为机体提供能量^[20]。有研究报道，增加肝糖原和肌糖原的含量有利于增加运动耐力，增强机体的抗疲劳能力^[21]。LA、BUN分别是葡萄糖、蛋白质产生ATP时的产物，两者在体内积累会影响内环境稳态，导致细胞内酸中毒和肌肉疲劳的发生。同时，LA和BUN是评价机体疲劳程度的重要指标^[22]。Sun等^[23]研究发现，给予金丝桃素治疗可以增加CFS小鼠糖原含量，减少血清中LA、BUN积累，促进骨骼肌中ATP的产生，从而发挥对抗CFS的作用。本研究还发现，药物干预显著提高了CFS小鼠腓肠肌ATP水平，增加了肌糖原和肝糖原的储备，降低了血清中LA和BUN的积累，提示益气清肺颗粒可以促进能量产生，改善能量代谢状态，从而增强机体的抗疲劳能力。

AMPK信号通路与CFS的发生密切相关。研究发现，CFS患者及CFS模型小鼠的骨骼肌组织均存在AMPK激活障碍^{[5, 24]}。AMPK作为能量调节因子，在ATP不足时，通过触发一系列代谢反应来恢复能量平衡。文献报道，促进CFS小鼠腓肠肌AMPK/PGC-1α通路激活，可以增加ATP产量，改善腓肠肌能量代谢状态，缓解慢性疲劳^[25-26]。本研究结果也显示，益气清肺颗粒显著提升了CFS小鼠腓肠肌中p-AMPK、PGC-1α的表达水平，提示益气清肺颗粒可能激活了AMPK/PGC-1α信号通路，这有利于改善能量代谢紊乱状态，缓解疲劳。然而，AMPK的上游调节因子CaMKK2各组水平并无差异，提示药物可能并非通过调节CaMKK2蛋白的表达水平来调控AMPK的磷酸化，其具体作用机制仍然需要进一步探究。近些年研究发现，AMPK可以直接或间接通过PGC-1α调节SIRT3的表达，SIRT3作为一种线粒体蛋白脱乙酰酶，可以通过上调线粒体中多种与能量代谢相关酶的活性，从而增加ATP产量^[27]。因此，本研究也检测了腓肠肌中SIRT3的表达水平，发现中、高剂量的益气清肺颗粒可以显著上调SIRT3表达水平，因此推测益气清肺颗粒可能通过调控腓肠肌AMPK/PGC-1α/SIRT3信号通路发挥能量代谢调节作用，从而促进ATP生成，减少有害代谢产物积累，增加运动耐力，缓解疲劳，但是益气清肺颗粒是否能够直接调控该通路发挥抗疲劳作用有待进一步探究。

5-HT系统功能活跃与CFS具有相关性。5-HT作为神经系统的重要神经调节剂，参与情绪、睡眠、运动活动和学习记忆的调控，中枢5-HT水平异常升高，会使大脑皮层兴奋性降低，增加疲劳情绪的产生^[28]。研究发现，直接向大鼠注射5-HT再摄取抑制剂——氟西汀后，大鼠运动能力显著下降，具体表现为转棒时间缩短了25%~40%，而使用5-HT合成抑制剂会延长运动时间，提高运动耐力^[29]。因此，降低5-HT系统活跃度有利于缓解慢性疲劳。本研究结果显示，益气清肺颗粒可以显著降低中枢神经系统游离色氨酸和5-HT的水平，提示益气清肺颗粒可能具有改善5-HT系统功能的作用，从而有助于缓解疲劳情绪，与韩玲等^[30]的研究结果具有一致性。

综上所述，本研究初步证实了益气清肺颗粒可以改善由强迫游泳诱导的CFS小鼠的疲劳症状，其作用机制在于改善骨骼肌能量代谢，调节中枢5-HT水平，其潜在的分子作用机制可能与激活腓肠肌AMPK/PGC-1α/SIRT3信号通路有关，但仍有待进一步研究。本研究为益气清肺颗粒在CFS治疗中的潜在应用提供了依据，为CFS的治疗提供了新的选择性。